[發明專利]人KRAS基因多點突變單管聯檢熒光PCR方法、試劑盒及體系

有效

• 申請號: 201710090387.8
• 申請日: 2017-02-20
• 公開（公告）號: CN106868127B
• 公開（公告）日: 2019-09-10
• 發明（設計）人: 黃臨迷;宋卓;袁夢兮
• 申請（專利權）人: 人和未來生物科技（長沙）有限公司
• 主分類號: C12Q1/6886
• 分類號: C12Q1/6886;C12N15/11
• 代理公司: 深圳鼎合誠知識產權代理有限公司 44281
• 代理人: 孫銀行;彭家恩

1.一種人KRAS基因多點突變單管聯檢熒光PCR方法，其特征在于，包括：

在熒光PCR體系中，以含有人KRAS基因突變位點的DNA作為模板進行熒光PCR反應，其中所述熒光PCR體系中包括：

(a)用于檢測KRAS Gly12Asp突變位點的上游引物序列：

GAATATAAACTTGTGGTAGTTGGAGCdIGA(SEQ ID NO：1)，

用于檢測KRAS Gly12Ala突變位點的上游引物序列：

GGAATATAAACTTGTGGTAGTTGGAGCdIGC(SEQ ID NO：2)，

用于檢測KRAS Gly12Val和Gly12Ser突變位點的上游引物序列：

GAATATAAACTTGTGGTAGTTGGAGCdIGT(SEQ ID NO：3)，

用于檢測KRAS Gly12Arg和Gly12Cys突變位點的上游引物序列：

GGAATATAAACTTGTGGTAGTTGGAGdITC(SEQ ID NO：4)，

用于檢測KRAS Gly13Asp突變位點的上游引物序列：

GGAATATAAACTTGTGGTAGTTGGAGCTGGdIGT(SEQ ID NO：5)，

其中，所述上游引物序列中的dI表示脫氧次黃嘌呤核苷酸；

(b)用于檢測KRAS各種突變位點的下游引物序列：

CCTCTATTGTTGGATCATATTCGT(SEQ ID NO：6)；

(c)用于檢測KRAS各種突變位點的熒光探針序列：

GAGTGCCTTGACGATACAGCTAATTC(SEQ ID NO：7)，

其中，所述熒光探針序列的5’端具有熒光基團，3’端具有淬滅基團；

(d)Taq酶、UNG酶、dNTPs、dUTP、Mg²⁺和PCR緩沖液；

(e)第一添加劑和第二添加劑，所述第一添加劑包括牛血清白蛋白，所述第二添加劑包括二甲基亞砜、NH₄Cl和山梨糖醇水溶液。

2.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，所述熒光基團是FAM，所述淬滅基團是BHQ1。

3.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，所述熒光PCR體系中還包括：

用于KRAS監控的內標序列，包括：

上游引物序列為：CCTAGTAGGAAATAAATGTGATTTGCC(SEQ ID NO：8)，

熒光探針序列為：

TAGAACAGTAGACACAAAACAGGCTCAGGACTT(SEQ ID NO：9)，

下游引物序列為：CTGTCTTGTCTTTGCTGATGTTTCA(SEQ ID NO：10)，

其中，所述熒光探針序列的5’端具有熒光基團VIC，3’端具有淬滅基團BHQ1。

4.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，每50μL所述熒光PCR體系中含有：

Taq酶、UNG酶2個單位；10mM的dNTPs和2.5mM的dUTP 0.4μL；50mM的Mg²⁺1.5μL；10×PCR緩沖液5μL；10μM的引物序列各自1～2μL，10μM的探針序列3～4μL；含有人KRAS基因突變位點的DNA 20～40ng；10mg/mL牛血清白蛋白2μL，二甲基亞砜、250mM NH₄Cl和60％山梨糖醇水溶液1.25μL，以及余量的水。

5.根據權利要求4所述的方法，其特征在于，所述每50μL所述熒光PCR體系中還含有：

10μM的所述內標的引物序列各自1μL，以及10μM的所述內標的探針序列0.5μL；所述內標的引物序列和探針序列包括：

用于KRAS監控的內標序列，包括：

上游引物序列為：CCTAGTAGGAAATAAATGTGATTTGCC(SEQ ID NO：8)，

熒光探針序列為：

TAGAACAGTAGACACAAAACAGGCTCAGGACTT(SEQ ID NO：9)，

下游引物序列為：CTGTCTTGTCTTTGCTGATGTTTCA(SEQ ID NO：10)，

其中，所述熒光探針序列的5’端具有熒光基團VIC，3’端具有淬滅基團BHQ1。