[發明專利]一種熒光定量PCR檢測鑒定比薩茶蝸牛的方法

有效

• 申請號: 201710089556.6
• 申請日: 2017-02-20
• 公開（公告）號: CN106755524B
• 公開（公告）日: 2019-08-23
• 發明（設計）人: 周衛川;王沛;王宇;林俊宏;林陽武
• 申請（專利權）人: 福建出入境檢驗檢疫局檢驗檢疫技術中心
• 主分類號: C12Q1/6888
• 分類號: C12Q1/6888;C12Q1/6851
• 代理公司: 福州元創專利商標代理有限公司 35100
• 代理人: 蔡學俊;陳彩芳

本發明提供了一種熒光定量PCR檢測鑒定比薩茶蝸牛的方法，應用特異性引物及探針對比薩茶蝸牛的分子特征進行識別，其熒光定量PCR反應的上游引物為TPF：5’?GCTGGAAAGTGGAGGCCGTA?3’，下游引物為TPR：5’?GCGGCGTCGGTTAAGAGAGA?3’，熒光探針為TPP：5’?FAM?AGCTGTTCCGGGCACCAAGACGTCACG?BHQ?3’，5’端標記的熒光報告基團是FAM，3’端標記的熒光淬滅基團是BHQ。本發明方法能夠快速、準確地檢測鑒定比薩茶蝸牛，不僅具有特異性強、靈敏度高、耗時短、結果判定準確方便的優點，而且無需PCR后處理，能有效避免假陽性和交叉污染。

技術領域

本發明涉及一種熒光定量PCR檢測鑒定比薩茶蝸牛的方法，屬于植物檢疫技術領域，適用于進出境口岸檢疫及農業生產上比薩茶蝸牛的快速檢測鑒定。

背景技術

比薩茶蝸牛Theba pisana 屬于柄眼目Stylommatopgora，大蝸牛科Helicidae，茶蝸牛屬Theba，是我國新頒布的《中華人民共和國進境植物檢疫性有害生物名錄》中的成員。該蝸牛具有樹棲習性，抗干旱能力強，極易在林區、果園等新區建立種群，嚴重危害農林作物和園藝作物，而且蝸牛爬行過后留下的銀白色黏液痕跡也可嚴重降低作物的商品價值。比薩茶蝸牛貝殼與地中海白蝸牛Cernuella virgata等極為相似，往往難以區分，卵粒和幼螺的鑒定則更為困難。由于歷史的原因，目前國境口岸的植物檢疫人員絕大多數為植物保護專業，對陸生軟體動物的分類知之甚少，這種局面給我國的實際檢疫工作造成了被動，也是世界各國檢驗檢疫部門共同面臨的技術難題。最近二十多年來，分子生物學技術飛速發展，20世紀90年代出現的熒光定量PCR技術在反應體系中加入熒光染料，通過熒光信號的傳遞來反映DNA擴增量，實現了快而準的檢測鑒定。迄今為止，尚未見用于比薩茶蝸牛檢測鑒定的熒光定量PCR技術。如果能設計出特異性引物及探針用熒光定量PCR擴增方法為比薩茶蝸牛的快速準確鑒定提供新的技術手段，這個難題就迎刃而解。本發明建立了一種熒光定量PCR方法檢測鑒定比薩茶蝸牛的技術，以適應當前國境口岸檢疫工作的需要。

發明內容

本發明針對傳統形態學和普通PCR鑒定技術所存在的不足開展研究，旨在提供一種準確性好、靈敏度高、特異性強的檢測方法，應用于比薩茶蝸牛的快速檢測鑒定。

本發明提供了一種熒光定量PCR檢測鑒定比薩茶蝸牛的方法，所述方法是應用特異性引物及探針對比薩茶蝸牛的分子特征進行識別，所述引物及探針為：

上游引物為TPF：5’- GCTGGAAAGTGGAGGCCGTA -3’，

下游引物為TPR：5’- GCGGCGTCGGTTAAGAGAGA-3’，

熒光探針為TPP：5’-FAM-AGCTGTTCCGGGCACCAAGACGTCACG-BHQ-3’， 5’端標記的熒光報告基團是FAM，3’端標記的熒光淬滅基團是BHQ，

以上引物及探針濃度均為10μmol/L。

本發明的熒光定量PCR反應體系總體積為25μL，其中2×TaqMan PCR Master Mix12.5μL，上、下游引物及探針各1μL，DNA模板2μL，余下用滅菌ddH₂O補足。

所述熒光定量PCR反應的程序為：95℃預變性5min；95℃ 10s，60℃ 34s，40個循環；結束反應。

本發明的顯著優點：本發明方法能夠快速、準確地檢測鑒定比薩茶蝸牛。本發明為植物檢疫中對檢疫性有害生物比薩茶蝸牛的檢測鑒定提供了新的技術手段，對于防止比薩茶蝸牛的傳入和擴散具有重要意義。

本發明所提供的一種熒光定量PCR檢測鑒定比薩茶蝸牛的方法具有以下有益效果：