[發明專利]一組甲基化基因及其檢測方法

在審

• 申請號: 201710088498.5
• 申請日: 2017-02-20
• 公開（公告）號: CN106868124A
• 公開（公告）日: 2017-06-20
• 發明（設計）人: 孔祥陽;武超群;黃新偉;付玉;郭麗瓊
• 申請（專利權）人: 昆明理工大學
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12N15/11
• 代理公司: 北京匯捷知識產權代理事務所(普通合伙)11531
• 代理人: 李宏偉

技術領域

本發明屬于醫學檢測技術領域，尤其涉及一種一組甲基化基因及其檢測方法。

背景技術

肺癌作為一種常見的惡性腫瘤，近幾十年內其發病、死亡率于全球總體上呈上升趨勢，在惡性腫瘤中往往處于首位。許多研究都表明，肺癌的發生發展是一個多基因、多因素及多階段的復雜過程，其大致涉及兩大機制，一是表觀遺傳學層面，二是遺傳學層面。其中表觀遺傳學在肺癌發生發展過程中起著舉足輕重的作用，而DNA甲基化則是表觀遺傳學最重要的一種修飾方式。

DNA甲基化是真核生物體內的一種內源性修飾過程，一般是指由于DNA甲基轉移酶(DNMTs)的催化，生物體把S-腺苷甲硫氨酸(SAM-CH3)中的甲基(-CH3)連接到胞嘧啶核苷酸(Cytosine，C)的第5位殘基上，從而使胞嘧啶(C)甲基化為5'-甲基胞嘧啶(5'-Methylcytosine，5'-mC)的過程。胞嘧啶核苷酸(C)能與鳥嘌呤核苷酸(G)通過磷酸二酯鍵共價結合為二核苷酸(即CpG)。正常健康人基因組中約80％左右的CpG都分散分布在基因組內，且都處于甲基化狀態，比如重復序列。另有一小部分CpG則呈高度密集狀態，通常當胞嘧啶(C)與鳥嘌呤(G)的總和超過4種堿基總和的50％左右時，我們把這種富含CpG結構的DNA片段稱為CpG島。通常CpG島位于5'端的基因啟動子、第一外顯子以及3'末端區域，且一般處于非甲基化狀態。

腫瘤DNA異常甲基化一般有兩種形式，即局部相關基因CpG島的甲基化水平升高以及CpG島以外的整體基因組DNA的甲基化水平降低。整體基因組DNA的低甲基化水平可能激活原來保持沉默的基因，尤其是ras及fos等原癌基因；而局部相關基因啟動子CpG島的異常高甲基化則可能導致某些基因(尤其是抑癌基因)的轉錄沉默。而近來一系列研究也已經證實，腫瘤發生發展中某些抑癌基因5'端CpG島(尤其是啟動子區域)會發生異常甲基化，從而使該基因轉錄受到抑制，這是抑癌基因表達失活的關鍵。同時研究發現，許多基因的異常甲基化都與腫瘤的發生發展有關，而目前的研究主要集中在4類基因，即抑癌基因(包括p16^INK4a、p15^INK4b、p14^ARF、APC等)、DNA修復基因(MLH1與MGMT等)、代謝酶基因(GSTP1)與腫瘤分子侵襲轉移相關基因(DAPK、CDH1等)。這些基因涉及細胞周期調控、細胞間信號轉導、細胞凋亡、腫瘤的侵襲轉移及DNA損傷修復等過程。

目前針對肺癌的早期診斷依舊相當困難，其早期診斷率低。影像學檢查(如常規CT檢查)很難檢出1cm以下的腫塊；而傳統的支氣管刷檢法及痰脫落細胞學法的檢測結果也差強人意；作為肺癌臨床診斷金標準的病理組織學診斷，一般都需獲取組織活檢標本，有創，傷害大，對于那些不能耐受手術檢查或者不具備相應檢查條件的患者往往并不適用，且通過病理檢測得到的結果早已失去了早期診斷的意義；腫瘤標志物(尤其是血漿或血清中的分子標志物)的檢測來進行肺癌的早期篩查，具有特異性強、敏感度高、標本易獲取以及無創等優點，且便于觀察預后。近些年，有關肺癌腫瘤標志物研究以及檢測方法層出不窮，如“液體活檢”技術。此技術就是一種直接從血漿或其他體液中檢測循環腫瘤細胞或游離DNA(cfDNA)的技術，有望把肺癌的早期診斷推向一個新的高度。

發明內容

本發明的目的在于提供一種一組甲基化基因及其檢測方法，旨在解決目前針對肺癌的早期診斷依舊相當困難，其早期診斷率低，影像學方法(如常規CT檢查)很難發現1cm以下的腫塊；而傳統的支氣管刷檢法及痰脫落細胞學法的檢測結果也差強人意；作為肺癌臨床診斷金標準的病理組織學診斷，一般都需獲取組織活檢標本，有創，傷害大，對于那些不能耐受手術檢查或者不具備相應檢查條件的患者往往并不適用，且通過病理檢測得到的結果早已失去了早期診斷的意義的問題。

本發明是這樣實現的，一組甲基化基因，所述一組甲基化基因包括p16、DLEC1、CDH1、DAPK及RUNX3基因；DNA基因序列分別為：SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5。

本發明另一目的在于提供一種一組甲基化基因的檢測方法，所述一組甲基化基因的檢測方法包括以下步驟：

1)抽取受檢者外周血20ml，并將其血漿分離；提取上述血漿中的cfDNA,并對其進行亞硫酸鹽修飾；