[發明專利]一組甲基化基因及其檢測方法

在審

• 申請號: 201710088498.5
• 申請日: 2017-02-20
• 公開（公告）號: CN106868124A
• 公開（公告）日: 2017-06-20
• 發明（設計）人: 孔祥陽;武超群;黃新偉;付玉;郭麗瓊
• 申請（專利權）人: 昆明理工大學
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12N15/11
• 代理公司: 北京匯捷知識產權代理事務所(普通合伙)11531
• 代理人: 李宏偉

1.一種一組甲基化基因，其特征在于，所述一組甲基化基因包括p16、DLEC1、CDH1、DAPK及RUNX3基因；DNA基因序列分別為：SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5。

2.一種如權利要求1所述一組甲基化基因的檢測方法，其特征在于，所述一組甲基化基因的檢測方法包括以下步驟：

1)抽取受檢者外周血20ml，并將其血漿分離；提取上述血漿中的cfDNA,并對其進行亞硫酸鹽修飾；

2)分別設計p16、DLEC1、CDH1、DAPK及RUNX3基因的外引物、甲基化引物及非甲基化引物，對上述亞硫酸鹽修飾過的cfDNA中的p16、DLEC1、CDH1、DAPK及RUNX3基因進行巢氏甲基化特異性PCR兩輪擴增；

3)將上述PCR擴增產物行瓊脂糖凝膠電泳，并在凝膠成像系統下觀察結果，并行測序驗證；

4)對上述觀察結果中p16、DLEC1、CDH1、DAPK及RUNX3基因甲基化情況進行聯合檢測評估。

3.如權利要求2所述的一組甲基化基因的檢測方法，其特征在于，所述一組甲基化基因的檢測方法具體包括：

步驟一，血漿樣本的分離及保存：抽取受檢者外周血20ml，并立即置于4℃冰箱短時間保存1h，備用；把分別裝有10ml左右外周血樣本的兩只抗凝管置于低速離心機，然后2500rpm，4℃離心，15min，使樣品分血漿、白細胞、紅細胞三層；用移液槍小心輕柔的吸出抗凝管中最上層2/3的血漿，置于新的15ml離心管中；然后把取出的血漿再次2500rpm，4℃離心，10min；并把上清液分裝到幾管1.5ml離心管中，標記好后置于-80℃保存；

步驟二，血漿cfDNA的提取及其濃度測定；

步驟三：cfDNA的瓊脂糖凝膠電泳：制備1％的瓊脂糖凝膠；并且等瓊脂糖溶液溫度降至65℃時加入花青素；制備膠板；將冷卻到65℃左右的瓊脂糖凝膠溶液倒入制膠槽內，室溫下靜置，直至完全凝固；將凝固后的膠板放入已倒入1×TAE緩沖液的電泳槽中浸潤，然后開始點樣；取4μl血漿cfDNA與2μl的6×loading Dye混合，然后依據樣品順序逐孔點樣；在100V電壓下電泳20分鐘，然后取出凝膠，置于凝膠成像系統下觀察結果；

步驟四，血漿cfDNA的亞硫酸氫鹽修飾；

步驟五，血漿cfDNA中p16、DLEC1、CDH1、DAPK及RUNX3基因的巢式甲基化特異性PCR擴增；

步驟六：PCR產物的瓊脂糖凝膠電泳；

步驟七：判斷標準:把只有單獨的甲基化M引物擴增成功或者是甲基化M引物及非甲基化U引物都擴增成功判斷為此基因有陽性異常甲基化，而把只有單獨的非甲基化引物U擴增成功判斷為此基因陰性無異常甲基化；M代表甲基化，U代表非甲基化；

步驟八：PCR結果的驗證，包括：

(1)PCR產物的選取：取出p16、DLEC1、CDH1、DAPK及RUNX3基因在血漿cfDNA中的nMSP第二輪PCR擴增產物；

首先在這5個基因的所有M擴增成功的陽性樣本里分別隨機選取幾個p16陽性樣本、幾個DLEC1陽性樣本、幾個CDH1陽性樣本、幾個DAPK陽性樣本及幾個RUNX3陽性樣本，并挑出這些被選取的陽性樣本的甲基化引物M擴增產物，用以驗證其是否為真的陽性；

其次在這5個基因的所有只有U擴增成功的陰性樣本里分別隨機選取幾個p16陰性樣本、幾個DLEC1陰性樣本、幾個CDH1陰性樣本、幾個DAPK陰性樣本及幾個RUNX3陰性樣本，并挑出這些被選取的陰性樣本的非甲基化引物U擴增產物，用以驗證其是否為真的陰性；

(2)PCR產物的連接和轉化；

(3)陽性克隆子的篩選；

(4)測序:挑取陽性克隆子對應編號平板上的菌落，沾在600μl的LB-Amp液體培養基中，再置于搖床上，200rpm，37℃，過夜，進行擴大培養；作甲基化測序；

(5)驗證：運用Bio analysis軟件，結合NCBI上下載的參考序列，與目的基因p16、DLEC1、CDH1、DAPK及RUNX3各幾個被選取的陽性樣本中甲基化引物M擴增產物的陽性克隆子測序結果作比對，觀察目的片段上CpG島異常甲基化情況，驗證其是否為對應甲基化引物M的正確擴增產物，是否為假陽性；同時，與目的基因p16、DLEC1、CDH1、DAPK及RUNX3各幾個被選取的陰性樣本中非甲基化引物U擴增產物的陽性克隆子測序結果作比對，對比目的片段上CpG島甲基化情況驗證其是否為對應非甲基化引物U的正確擴增產物，是否為假陰性；

步驟九，數據分析與統計處理：結合臨床資料及健康對照血漿樣本，運用SPSS 20.0統計軟件進行數據分析，主要運用卡方檢驗，P<0.05則差異有統計學意義。