[發(fā)明專利]基于再生液優(yōu)化的表面等離子共振技術同時檢測多種環(huán)境激素的方法

在審

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• 申請日: 2017-02-17
• 公開（公告）號: CN106996923A
• 公開（公告）日: 2017-08-01
• 發(fā)明（設計）人: 丁利;蘇榮欣;夏寅強;齊崴;王利兵
• 申請（專利權）人: 丁利;蘇榮欣;夏寅強;王利兵;齊崴
• 主分類號: G01N21/552
• 分類號: G01N21/552;G01N33/74
• 代理公司: 天津創(chuàng)智天誠知識產權代理事務所(普通合伙)12214
• 代理人: 陳昌娟

技術領域

本發(fā)明屬于檢測方法領域，特別是涉及一種基于再生液優(yōu)化的表面等離子共振技術同時檢測多種環(huán)境激素的方法。

背景技術

近些年來，環(huán)境激素作為一種生物機體以外的激素類物質，已經(jīng)被廣泛的應用于人們的日常生活中。雖然環(huán)境激素給人們帶來了一定的經(jīng)濟效益，但是其在環(huán)境和食品中的殘留嚴重的影響著人類身體健康。而且，多數(shù)環(huán)境激素屬于持久性有機污染物，很難降解，并具有一定的蓄積毒性，因此，對于環(huán)境激素的監(jiān)控與分析勢在必行。

目前，環(huán)境激素大多是通過高效液相色譜、液相色譜-質譜聯(lián)用以及酶聯(lián)免疫法(ELISA)等方法進行檢測分析，但是由于儀器操作技術性強、耗時長、樣品前處理繁瑣、基質成分復雜、ELISA中樣品用量浪費以及不能重復使用等缺陷，限制了這些傳統(tǒng)方法的應用。因此，需要開發(fā)一種更加可靠、高效、靈敏的檢測手段。

表面等離子共振生物傳感器(Surface Plasmon Resonance，SPR)，具有無需標記、高靈敏、快速檢測等特點，是環(huán)境激素檢測的理想工具之一。結合免疫檢測技術，利用抗體與抗原的結合的原理，對特定的目標物分子進行定性或者定量分析，而且抗體等蛋白類物質具有較大的分子量，能夠引起較高的SPR響應值變化，可以廣泛應用于小分子物質(如雙酚A、塑化劑等)的環(huán)境激素檢測。此外，由于環(huán)境激素種類繁多，使得傳統(tǒng)的檢測過程復雜繁瑣，單檢測通道的SPR傳感器無法滿足同時檢測多種環(huán)境激素的要求。因此，迫切需要開發(fā)基于SPR技術的新型檢測方法。

發(fā)明內容

針對現(xiàn)有技術中存在的不足，本發(fā)明提供一種基于再生液優(yōu)化的表面等離子共振技術同時檢測多種環(huán)境激素的方法。

本發(fā)明是通過以下技術方案實現(xiàn)的：

一種基于再生液優(yōu)化的表面等離子共振技術同時檢測多種環(huán)境激素的方法，包括以下步驟：

(1)傳感芯片表面包被原或抗體的固定：將各環(huán)境激素殘留組分的包被原或抗體混合至混合液的體積為50-150μL，所述各包被原或抗體在所述混合液中的濃度均為5-20μg/mL，再利用活化酯法(EDC/NHS)將所述混合液固定在所述傳感芯片表面固定；

(2)標準溶液配制：用0.01-0.1mol/LpH為6-8的羥乙基哌嗪乙硫磺酸鹽緩沖液(HBS緩沖液)配置各殘留組分的標準樣品儲備液，所述標準樣品儲備液的濃度均為0.1-1mg/mL；

量取各標準樣品儲備液，配制其相應的標準原液；用羥乙基哌嗪乙硫磺酸鹽緩沖液將標準原液配制成不同濃度的標準溶液與過量的固定濃度的相應抗體或包被原混合孵化，得到不同濃度的待測物混合液；

(3)測試再生液洗脫能力：測試HCl溶液、NaOH溶液、氯化鎂溶液和甘氨酸-鹽酸溶液對于步驟(1)得到的傳感芯片表面各環(huán)境激素抗體的洗脫情況，選出各組分的最佳再生條件，并對比其再生液洗脫能力的強弱；

(4)建立標準工作曲線：

單組分檢測：采用表面等離子共振譜傳感器測量，通入50-100μL步驟(2)得到的混合液，記錄表面等離子體共振傳感器的響應信號變化，繪制標準工作曲線，并進行多項式曲線擬合，獲得單組分回歸曲線的方程；再依次測得其它環(huán)境激素的標準工作曲線及單組分回歸曲線的方程；

多組分同時檢測：采用表面等離子共振譜傳感器測量，將多種步驟(2)制備的標準溶液與過量的抗體或包被原混合孵化，取孵化后的混合液50-100μL，通入傳感器，記錄下表面等離子體共振傳感器總體的響應信號變化；然后按照步驟(3)的的測試結果，依再生液洗脫能力由弱到強的順序依次進樣洗脫，記錄每次殘留抗體或包被原的響應值變化；根據(jù)不同濃度孵化后的混合液及其相應再生后殘留抗體或包被原的響應信號值繪制標準工作曲線，并進行多項式曲線擬合，獲得多組分回歸曲線方程；

(5)定量檢測：對于未知含量的含多種環(huán)境激素的未知樣品進行同時檢測，向所述未知樣品的待測液中分別加入過量的抗體或包被原，混合孵化后進樣，記錄總體的響應值變化；按照再生液洗脫能力由弱到強的順序依次進樣洗脫，記錄芯片表面每次殘留抗體或包被原的響應值變化；將殘留抗體或包被原的響應值代入步驟(4)得到的多組分檢測的標準工作曲線以及相應的單組分檢測標準工作曲線，計算各環(huán)境激素的濃度值；依次類推，實現(xiàn)對于環(huán)境激素的定量檢測；

(6)通入0.01-0.02mol/L、pH為1.2-2.5的甘氨酸-鹽酸緩沖溶液使芯片再生，再生后的芯片用于下次測量。

優(yōu)選的是，步驟(2)中，所述的pH值為7.4。