[發明專利]基于惡性瘧原蟲環狀體獨有基因的環介導等溫擴增法

在審

• 申請號: 201710086825.3
• 申請日: 2017-02-17
• 公開（公告）號: CN106801097A
• 公開（公告）日: 2017-06-06
• 發明（設計）人: 李健;張軼靜;姚毅;尚榮華
• 申請（專利權）人: 湖北醫藥學院
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68
• 代理公司: 重慶百潤洪知識產權代理有限公司50219
• 代理人: 劉立春

技術領域

本發明屬于惡性瘧原蟲檢測技術領域，具體涉及基于惡性瘧原蟲環狀體獨有基因的環介導等溫擴增法。

背景技術

瘧疾是嚴重危害人類健康的全球三大公共衛生問題之一，在可引起人體瘧疾的5種瘧原蟲中，由惡性瘧原蟲引起的惡性瘧最為嚴重，常以畏寒、發熱、頭痛為首發癥狀，并發癥多，若不及時治療容易危及生命。該病在撒哈拉以南非洲地區流行普遍，發病率和死亡率極高，特別是孕婦和五歲以下兒童深受其害。

20世紀70年代以后，隨著瘧疾疫情下降，低原蟲血癥患者所占比例增大，混合感染病例增多。此外，病人藥物治療后的復查或正處于慢性感染階段等對鏡檢的要求提高。常規血膜涂片染色鏡檢法很可能會導致誤診或漏診，因此，作為金標準的鏡檢已難以適應疫情變化后的檢測需求。此外，由于鏡檢需要長時間觀察、專業判別和復核，難以廣泛應用。同時，免疫學方法的不穩定，PCR耗時長、花費高，使得一直以來都難以找到一種實用性和適用性兼備的惡性瘧原蟲檢測方法。2016年世界瘧疾報告顯示，2015年全球約有2.12億瘧疾新增病例，其中死亡病例約429000例。目前，我國瘧疾疫情已經由本地病例為主轉變為輸入性病例為主，且輸入性病例比例逐年上升。特別是近年來，隨著國內外經貿往來頻繁，出國經商、旅游、留學和度假日益增多，造成我國輸入性瘧疾疫情愈來愈突出。因此，尋找一種操作簡單、快速高效、高特異性和高靈敏度的檢測方法迫在眉睫。傳統的瘧疾檢測方法是厚薄血膜涂片經染色后鏡檢。其優點是操作簡單、成本低，能夠進行蟲種鑒別；不足之處在于其費時、費力，對檢驗者的專業要求高，特別是檢測低原蟲血癥樣本時易漏診。因此，研究人員建立了基于酶聯免疫吸附試驗(ELISA)和間接免疫熒光試驗(IFA)的瘧疾免疫學快速診斷方法。這些方法能夠實現檢出瘧原蟲感染的目的，敏感性可與專業鏡檢媲美，然而其檢測效能并不穩定。隨后，研究人員開發了基于DNA擴增的分子生物學技術，最常用的有PCR、巢式PCR和實時定量PCR。與鏡檢相比，分子生物學方法具有更高的靈敏度(最低可檢測1～5個瘧原蟲/μl)和更好的特異性；但該技術存在費用高、須由專業高科技人員操作，且只能在設施配置齊全的實驗室進行，從而限制了其在基層醫院和醫療衛生條件相對較差地區的應用，而這些地區通常又是瘧疾流行范圍最廣、危害最嚴重的地區。因此，迫切需要研發一種新的瘧疾診斷技術，以彌補鏡檢、免疫學和常規分子生物學方法的不足。

環介導等溫擴增法(Loop-mediated isothermal amplification,LAMP)是2000年開發出來的一種新的恒溫核酸擴增技術。其特點是針對靶基因的6個區域設計4種特異引物，利用一種鏈置換DNA聚合酶在等溫條件(63℃左右)下溫育30～60min即可完成DNA擴增反應。與普通PCR相比，LAMP技術不需要模板熱變性、復雜的溫度循環、長時間電泳及凝膠成像等過程，具有簡單、快速、高度靈敏、特異性強的特點，這些獨特的優勢使其更能為廣大醫務工作者所接受。目前，已建立了基于惡性瘧原蟲編碼CSP蛋白基因和18S rRNA的LAMP技術，并廣泛應用于現場調查。然而，此類高度保守基因在瘧原蟲屬乃至瘧原蟲科都廣泛存在，加之LAMP法是一種高敏感性和特異性的技術，極易造成假陽性，從而導致蟲種誤判。

發明內容

基于上述技術問題，本發明提供了基于惡性瘧原蟲環狀體獨有基因的環介導等溫擴增法，用以解決現有惡性瘧原蟲檢測方法存在誤判等諸多的問題。

為實現上述技術目的，本發明采用的技術方案如下：

基于惡性瘧原蟲環狀體獨有基因的環介導等溫擴增法，包括以下步驟：

步驟一，生物信息學分析：搜索PlasmoDB數據庫，篩選僅在惡性瘧原蟲紅細胞內期環狀體期高表達(前20％)且該種瘧原蟲特有基因，利用OrthoMCL database驗證其在真核生物不同種屬間的分布情況，同時，篩選僅在惡性瘧原蟲紅內期滋養體或裂殖體階段高表達(前20％)且其特有基因各一個，做為平行對照；

步驟二，LAMP引物設計：利用LAMP在線設計軟件PrimerExplorerV4對步驟一所篩選到的特有基因進行LAMP引物設計，參數設置為默認值，選擇分數排名前二至前五的LAMP引物，然后進行LAMP引物合成；