[發(fā)明專利]基于惡性瘧原蟲環(huán)狀體獨有基因的環(huán)介導等溫擴增法

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 201710086825.3
• 申請日: 2017-02-17
• 公開（公告）號: CN106801097A
• 公開（公告）日: 2017-06-06
• 發(fā)明（設計）人: 李健;張軼靜;姚毅;尚榮華
• 申請（專利權）人: 湖北醫(yī)藥學院
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68
• 代理公司: 重慶百潤洪知識產(chǎn)權代理有限公司50219
• 代理人: 劉立春

1.基于惡性瘧原蟲環(huán)狀體獨有基因的環(huán)介導等溫擴增法，其特征在于，包括以下步驟：

步驟一，生物信息學分析：搜索PlasmoDB數(shù)據(jù)庫，篩選僅在惡性瘧原蟲紅細胞內(nèi)期環(huán)狀體期高表達(前20％)且該種瘧原蟲特有基因，利用OrthoMCL database驗證其在真核生物不同種屬間的分布情況，同時，篩選僅在惡性瘧原蟲紅內(nèi)期滋養(yǎng)體或裂殖體階段高表達(前20％)且其特有基因各一個，做為平行對照；

步驟二，LAMP引物設計：利用LAMP在線設計軟件PrimerExplorerV4對步驟一所篩選到的特有基因進行LAMP引物設計，參數(shù)設置為默認值，選擇分數(shù)排名前二至前五的LAMP引物，然后進行LAMP引物合成；

步驟三，模版DNA制備：使用血液基因組DNA提取試劑盒分別提取含有惡性瘧原蟲、間日瘧原蟲、約氏瘧原蟲的全血基因組DNA；使用血液/細胞/組織基因組DNA提取試劑盒提取感染弓形蟲的小鼠腹水DNA；上述試劑盒所提取的基因組DNA即為LAMP使用的模板DNA；

步驟四，引物配制：

LAMP引物存儲液配制：將步驟二得到的置于1.5ml離心管的LAMP引物干粉在12000r/min下離心1min，以使粘在管蓋和管壁的粉末全部集中在管底。

配制母液：根據(jù)引物干粉摩爾數(shù)溶解干粉于1.5ml離心管，配制內(nèi)引物(FIP/BIP)母液的濃度為200pmol/μl，外引物(F3/B3)母液的濃度為100pmol/μl，將配制好的內(nèi)引物(FIP/BIP)母液和外引物(F3/B3)母液室溫放置5min，振蕩混合均勻后放入離心機，在12000r/min下離心1min；

LAMP引物工作液PM制備：取200pmol/μl的FIP母液和BIP母液各4μl、100pmol/μl的F3母液和B3母液各1μl，最后加入10μl超純水制備成20μl工作液備用；

步驟五，LAMP法的建立和敏感性、特異性評價：

A.LAMP反應體系包括12.5μl 2×RM反應液，1μl步驟四得到的LAMP引物工作液PM，1μl和相對應基因的DNA模板，1μl Bst DNA Polymerase，加超純水至25μl，混合均勻后加入12.5μl密封液再次離心，最后將1μl顯色液滴在PCR管蓋中間，輕輕蓋緊管蓋，恒溫金屬浴內(nèi)反應，終止反應后顛倒PCR管數(shù)次或1000～16000r/min離心30sec～3min，使顯色液與反應混合液充分混勻，短暫離心后觀察反應液顏色變化，若呈現(xiàn)綠色則為陽性(有核酸擴增)，若呈現(xiàn)棕紅色則為陰性(無核酸擴增)；

B.將步驟三得到的含有惡性瘧原蟲基因組DNA的全血DNA用超純水進行倍比稀釋，然后按照步驟五中A所述的LAMP染色法檢測，評價所檢測基因的敏感性；

C.將步驟三得到的含有惡性瘧原蟲基因組DNA的全血DNA、含有間日瘧原蟲基因組DNA的全血DNA、含有約氏瘧原蟲基因組DNA的全血DNA、含有弓形蟲基因組DNA的腹水DNA；按照步驟五中A所述的LAMP染色法檢測，以18S rRNA設計的LAMP引物作為陽性對照引物，進行特異性評價，同時設立空白對照和陰性對照。

2.根據(jù)權利要求1所述的基于惡性瘧原蟲環(huán)狀體獨有基因的環(huán)介導等溫擴增法，其特征在于：所述步驟一中惡性瘧原蟲特有基因為PF3D7_1253300，PF3D7_0202200,PF3D7_0702300,PF3D7_1001900,PF3D7_1002000,PF3D7_1148900,PF3D7_1240100,PF3D7_1301700與PF3D7_1334700。

3.根據(jù)權利要求2所述的基于惡性瘧原蟲環(huán)狀體獨有基因的環(huán)介導等溫擴增法，其特征在于：所述步驟一中惡性瘧原蟲紅內(nèi)期滋養(yǎng)體階段高表達(前20％)特有基因為PF3D7_0220300。

4.根據(jù)權利要求3所述的基于惡性瘧原蟲環(huán)狀體獨有基因的環(huán)介導等溫擴增法，其特征在于：所述步驟一中惡性瘧原蟲紅內(nèi)期裂殖體階段高表達(前20％)特有基因為PF3D7_1401600。