[發明專利]一種染色質免疫共沉淀樣品快速制備方法

有效

• 申請號: 201710086482.0
• 申請日: 2017-02-17
• 公開（公告）號: CN106801096B
• 公開（公告）日: 2019-11-12
• 發明（設計）人: 杜海寧;李鋒;王洪巖;鄭亮德;舒文杰;洪斌;李俊峰
• 申請（專利權）人: 阿卡斯特（武漢）生物技術有限公司
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68
• 代理公司: 南京縱橫知識產權代理有限公司 32224
• 代理人: 董建林

本發明公開了一種染色質免疫共沉淀樣品快速制備方法，包括：對細胞進行甲醛交聯，固定蛋白與核酸的復合物，將蛋白核酸復合物抽提出來，再將染色質片段通過超聲或酶解打斷成小片段；將抗體掛到固相支持物磁珠上，再將獲得的小片段加到制好的磁珠上孵育，獲得磁珠抗原抗體復合物，孵育完成后將未結合物質洗去，對磁珠抗原抗體復合物進行重懸，獲得待檢測的磁珠抗原抗體復合物樣品。本發明方法操作簡單，制備得到的磁珠復合物樣品可直接用于PCR檢測或者擴增，構建DNA文庫，樣品制備時間明顯縮短，同時還避免了由于過多洗脫步驟造成的某些蛋白質與DNA富集信號較弱的缺陷，大大提高了檢測的靈敏度，且對后續的PCR鑒定和DNA片段擴增不會產生任何不良影響。

技術領域

本發明屬于染色質免疫共沉淀（ChIP）技術領域，更具體地，涉及染色質免疫共沉淀（ChIP）樣品快速制備方法。

背景技術

組蛋白是真核生物體細胞染色質中的堿性蛋白質，含精氨酸和賴氨酸等堿性氨基酸特別多，二者加起來約為所有氨基酸殘基的1/4。組蛋白與帶負電荷的雙螺旋DNA結合成DNA-組蛋白復合物。組蛋白是真核生物染色體的基本結構蛋白，是一類小分子堿性蛋白質，有五種類型：H1、H2A、H2B、H3及H4組蛋白，它們富含帶正電荷的堿性氨基酸，能夠同DNA中帶負電荷的磷酸基團相互作用。

許多組蛋白的各種翻譯后修飾（PTM）（即甲基化、乙?；⒎核鼗蚐UMO化）發生在賴氨酸位點。雖然在被覆蓋的組蛋白折疊域內發現了少數的修飾位點，但是翻譯后修飾在柔韌的N-末端尾部區域確是相當普遍的。許多組蛋白修飾能夠調節染色質結構中重要的功能性變化，并通過直接地改變染色質結構/動態變化或通過招募組蛋白修飾蛋白和/或核小體改構復合體來實現。

組蛋白翻譯后修飾已經被發現能影響許多基于染色質的反應，包括轉錄、異染色質的基因沉默和基因組穩定性。由于能影響到整個轉錄程序，與基因表達相關的修飾尤其具有特殊意義。在多種體外模型中，組蛋白翻譯后修飾代謝途徑的缺陷與基因表達失調有關。這在某些情況下也與人類疾病相關，并已在免疫缺陷和各種人類癌癥中得到驗證。因此，組蛋白是如何被調節的以及如何影響PTM-特異性結合蛋白的相互作用將繼續成為重大的研究領域。

特異性翻譯后修飾的基因組定位研究現在常采用染色質免疫共沉淀（ChromatinImmunoprecipitation，ChIP）的方法。染色質免疫共沉淀是基于體內分析發展起來的方法，也稱結合位點分析法，在過去十年已經成為表觀遺傳信息研究的主要方法。這項技術幫助研究者判斷在細胞核中基因組的某一特定位置會出現何種組蛋白修飾。ChIP不僅可以檢測體內反式因子與DNA的動態作用，還可以用來研究組蛋白的各種共價修飾與基因表達的關系。近年來，這種技術得到不斷的發展和完善。

富含有特定翻譯后修飾的基因組位點可以通過將含有感興趣的標記的染色質片段進行免疫沉淀來確定，然后在對與該翻譯后修飾相關的不同位點其所占的相對比例進行定量。

大多數染色質免疫共沉淀（ChIP）實驗方案的第一步是用甲醛處理細胞，通過交聯將染色質結合蛋白的位置固定。后生動物來源的細胞就可以直接進行裂解，而酵母細胞則必須先要進行細胞壁破碎，這可以通過機械力剪切或酶消化來完成。染色質可以以下列兩種方式之一來切成下片段：通過超聲打斷來得到200~500bp長的片段，或用微球菌核酸酶消化成單核小體。然后，添加與目標蛋白質特異的抗體，該抗體與目標蛋白形成免疫沉淀結合復合體，再去交聯，純化DNA即得到染色質免疫沉淀的DNA樣本，準備測序。測序時，將ChIP與第二代測序技術相結合的ChIP-Seq技術，能夠高效地在全基因組范圍內檢測與組蛋白、轉錄因子等互作的DNA區段。ChIP-Seq的原理是：首先通過染色質免疫共沉淀技術（ChIP）特異性地富集目的蛋白結合的DNA片段，并對其進行純化與文庫構建；然后對富集得到的DNA片段進行高通量測序。研究人員通過將獲得的數百萬條序列標簽精確定位到基因組上，從而獲得全基因組范圍內與組蛋白、轉錄因子等互作的DNA區段信息。