[發(fā)明專利]一種染色質(zhì)免疫共沉淀樣品快速制備方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201710086482.0
• 申請日: 2017-02-17
• 公開（公告）號: CN106801096B
• 公開（公告）日: 2019-11-12
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 杜海寧;李鋒;王洪巖;鄭亮德;舒文杰;洪斌;李俊峰
• 申請（專利權(quán)）人: 阿卡斯特（武漢）生物技術(shù)有限公司
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68
• 代理公司: 南京縱橫知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司 32224
• 代理人: 董建林

1.一種染色質(zhì)免疫共沉淀樣品快速制備方法，包括：對細(xì)胞進行甲醛交聯(lián)，固定蛋白與核酸的復(fù)合物，將蛋白核酸復(fù)合物抽提出來，再將染色質(zhì)片段通過超聲或酶解打斷成小片段；將抗體掛到固相支持物磁珠上，再將獲得的小片段加到制好的磁珠上孵育，獲得磁珠抗原抗體復(fù)合物，孵育完成后將未結(jié)合物質(zhì)洗去，其特征在于，對磁珠抗原抗體復(fù)合物進行重懸，獲得待檢測的磁珠抗原抗體復(fù)合物樣品；所述磁珠的初始添加量≤10μl。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的染色質(zhì)免疫共沉淀樣品快速制備方法，其特征在于，所述磁珠的初始添加量為10μl，所述抗體的初始添加量為1-10μl。

3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的染色質(zhì)免疫共沉淀樣品快速制備方法，其特征在于，包括如下步驟：

S1. 細(xì)胞裂解，獲得蛋白核酸復(fù)合物的小片段；

S2. 準(zhǔn)備磁珠，磁珠結(jié)合抗體：將磁珠完全重懸，制成磁珠重懸液，每個EP管中加入10μl磁珠重懸液，準(zhǔn)備兩份磁珠重懸液，一份結(jié)合抗體，一份去除非特異性蛋白；取1-10μl的抗體，加入到準(zhǔn)備好磁珠重懸液的EP管中，4℃旋轉(zhuǎn)、孵育1h；將磁珠抗體復(fù)合物從溶液中分離出來，吸去上清，清洗磁珠抗體復(fù)合物，制成磁珠抗體重懸液；

S3. 免疫共沉淀樣品制備：將S1獲得的蛋白核酸復(fù)合物的小片段中加入S2獲得的磁珠重懸液中，4℃旋轉(zhuǎn)1h，去除非特異性蛋白，收集上清；將上清加入所述磁珠抗體復(fù)合物的重懸液中，輕輕重懸，4℃旋轉(zhuǎn)、孵育2h，使抗原與磁珠抗體復(fù)合物結(jié)合；用500μl的洗滌緩沖液清洗磁珠抗原抗體復(fù)合物兩次，每次3min，清洗后分離，移去上清，再重懸；最后將磁珠抗原抗體復(fù)合物重懸于50μl dd H₂O中，取1-2μl用于后續(xù)檢測。

4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的染色質(zhì)免疫共沉淀樣品快速制備方法，其特征在于，步驟S3中第一次清洗磁珠抗原抗體復(fù)合物的洗滌緩沖液包括：50 mM HEPES-KOH，pH 7.5；140 mMNaCl；1 mM EDTA；0.1% Triton X-100。

5. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的染色質(zhì)免疫共沉淀樣品快速制備方法，其特征在于，步驟S3中第二次清洗磁珠抗原抗體復(fù)合物的洗滌緩沖液包括：39 mM NaH₂PO₄·H₂O；32.3 mMNa₂HPO₄·7 H₂O；154 mM NaCl，pH7.0。

6. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的染色質(zhì)免疫共沉淀樣品快速制備方法，其特征在于，步驟S1包括：向細(xì)胞培養(yǎng)皿中加入甲醛進行交聯(lián)，甲醛的終濃度為1%，37℃孵育10min，終止交聯(lián)，用4℃的PBS洗細(xì)胞2~3次，最后一次吸干PBS；加入500μl預(yù)冷的含蛋白酶抑制劑的細(xì)胞裂解緩沖液，冰上裂解30min；用預(yù)冷的細(xì)胞刮將細(xì)胞從培養(yǎng)瓶上刮下，將裂解液收集到1.5mlEP管中，超聲破碎，獲得蛋白核酸復(fù)合物的小片段。