[發(fā)明專利]基于日本血吸蟲尾蚴期基因的環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增法

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 201710086347.6
• 申請日: 2017-02-17
• 公開（公告）號: CN106636439A
• 公開（公告）日: 2017-05-10
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 李健;張軼靜;楊樹國;趙燕清;關(guān)瑋
• 申請（專利權(quán)）人: 湖北醫(yī)藥學(xué)院
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68
• 代理公司: 重慶百潤洪知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司50219
• 代理人: 劉立春

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于日本血吸蟲尾蚴期編碼蛋白基因檢測技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及基于日本血吸蟲尾蚴期基因的環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增法。

背景技術(shù)

日本血吸蟲是一種重要的人獸共患性疾病，是全球最嚴(yán)重的公共衛(wèi)生問題之一，主要流行于熱帶和亞熱帶的76個國家及地區(qū)，全球血吸蟲感染人數(shù)超2億人，6億人口受其感染威脅。全國共有453個血吸蟲病流行縣(市、區(qū))，總?cè)丝?.52億人；共有29980個流行村，總?cè)丝?861.30萬人。全國453個流行縣(市、區(qū))中，343個(占75.72％)達(dá)到血吸蟲病傳播阻斷標(biāo)準(zhǔn)；110個(占24.28％)達(dá)到傳播控制標(biāo)準(zhǔn)。2015年全國推算血吸蟲病77194例，現(xiàn)存晚期血吸蟲病人30843例。

日本血吸蟲病的診斷包括病原學(xué)、免疫學(xué)和分子生物學(xué)三大方法，而檢測日本血吸蟲的特異的DNA片段與病原學(xué)檢測具有同樣的確診價值。病原體基因組學(xué)給病原體分子生物學(xué)檢測帶來了新的工作方法和思路。日本血吸蟲全基因組測序已經(jīng)完成，蛋白編碼基因13469個，對尾蚴蛋白質(zhì)組的比較分析，共鑒定出1181個蛋白，將有力地促進(jìn)與這一重要傳染病相關(guān)的診斷、治療和預(yù)防的研究。

傳統(tǒng)的血吸蟲病原學(xué)檢測方法包括改良加藤法、尼龍袋集卵法、毛蚴孵化法與直腸鏡活組織檢查法，雖然都是可以確診的方法，但是由于受到諸多因素的限制，比較耗時費力、且存在一定的漏檢率。免疫學(xué)方法包括能夠檢測抗體的環(huán)卵沉淀試驗、IHA、ELISA、免疫印記技術(shù)、IFT、乳膠凝集試驗和快速試紙條等方法，雖然具有操作簡單、出結(jié)果快和經(jīng)濟(jì)等優(yōu)點，但不能區(qū)分是現(xiàn)癥患者還是既往感染，針對循環(huán)抗原的檢測方法雖然能夠區(qū)分現(xiàn)癥感染還是既往感染，但由于其在體液中的含量通常都很低，一般難以檢出，其敏感性還需進(jìn)一步加強(qiáng)。

目前，作為一種高效的檢測方法，環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增技術(shù)(Loop-mediated isothermal amplification,LAMP)不依賴任何專業(yè)儀器設(shè)備就能實現(xiàn)現(xiàn)場高效快速檢測，能避免傳統(tǒng)分子生物學(xué)方法對于溫度循環(huán)等條件的特殊要求所帶來的不便，具備實用性、高效性和簡便性的特點，其使用價值和現(xiàn)場應(yīng)用價值越來越明顯，有望成為較適用于血吸蟲現(xiàn)場調(diào)查的簡易技術(shù)方法。

LAMP方法在寄生蟲病的研究與應(yīng)用主要集中在蠕蟲和原蟲等方面，國內(nèi)外研究人員已對弓形蟲、牛帶絳蟲、細(xì)粒棘球絳蟲等寄生蟲單基因的LAMP檢測做了相關(guān)研究，建立LAMP方法，結(jié)果顯示均有很好的特異性和敏感性。但作為日本血吸蟲，還沒有相關(guān)的報道，并且現(xiàn)有的檢測方法相對復(fù)雜。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的是：旨在提供基于日本血吸蟲尾蚴期基因的環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增法，用來解決現(xiàn)有對日本血吸蟲檢測不準(zhǔn)確，且檢測特異性和敏感性不高的問題。

為實現(xiàn)上述技術(shù)目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案如下：

基于日本血吸蟲尾蚴期基因的環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增法，包括以下步驟：

步驟一，日本血吸蟲動物模型建立及血吸蟲樣本收集：

A.感染性釘螺經(jīng)超純水孵育，肉眼觀察水面有尾蚴逸出，接種環(huán)接尾蚴置于玻片，解剖鏡下觀察尾蚴活力，確定尾蚴活動良好，取昆明小鼠10只，腹部剪毛至裸皮膚，取蓋玻片置于載玻片上，接種環(huán)接30±5只尾蚴于蓋玻片，棉球擦拭小鼠皮膚，將載有尾蚴的載玻片貼于小鼠腹部皮膚約30sec～5min，建立小鼠感染血吸蟲模型；

B.感染40～50天后，斷頸處死小鼠，解剖觀察肝脾病理變化，收集日本血吸蟲成蟲，收集病變肝臟及結(jié)腸，置于EP管并在-20℃下保存?zhèn)溆茫?/p>

步驟二，模板DNA制備：收集釘螺孵育后的超純水，轉(zhuǎn)至離心管中，在1000～5000r/min條件下離心5～20min，棄上層清液，沉淀用血液/細(xì)胞/組織基因組DNA提取試劑盒提取尾蚴基因組DNA，感染性釘螺碾碎，收集螺肉及內(nèi)臟，用軟體動物基因組DNA提取試劑盒提取釘螺基因組DNA，提取后的尾蚴基因組DNA和釘螺基因組DNA均置于-20℃?zhèn)溆茫?/p>

步驟三，候選基因確定：選擇日本血吸蟲尾蚴期若干個預(yù)測蛋白基因作為目的基因；