[發(fā)明專利]基于日本血吸蟲(chóng)尾蚴期基因的環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增法

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• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201710086347.6
• 申請(qǐng)日: 2017-02-17
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN106636439A
• 公開(kāi)（公告）日: 2017-05-10
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 李健;張軼靜;楊樹(shù)國(guó);趙燕清;關(guān)瑋
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 湖北醫(yī)藥學(xué)院
• 主分類號(hào): C12Q1/68
• 分類號(hào): C12Q1/68
• 代理公司: 重慶百潤(rùn)洪知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司50219
• 代理人: 劉立春

1.基于日本血吸蟲(chóng)尾蚴期基因的環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增法，其特征在于：包括以下步驟：

步驟一，日本血吸蟲(chóng)動(dòng)物模型建立及血吸蟲(chóng)樣本收集：

A.感染性釘螺經(jīng)超純水孵育，肉眼觀察水面有尾蚴逸出，接種環(huán)接尾蚴置于玻片，解剖鏡下觀察尾蚴活力，確定尾蚴活動(dòng)良好，取昆明小鼠10只，腹部剪毛至裸皮膚，取蓋玻片置于載玻片上，接種環(huán)接30±5只尾蚴于蓋玻片，棉球擦拭小鼠皮膚，將載有尾蚴的載玻片貼于小鼠腹部皮膚約30sec～5min，建立小鼠感染血吸蟲(chóng)模型；

B.感染40～50天后，斷頸處死小鼠，解剖觀察肝脾病理變化，收集日本血吸蟲(chóng)成蟲(chóng)，收集病變肝臟及結(jié)腸，置于EP管并在-20℃下保存?zhèn)溆茫?/p>

步驟二，模板DNA制備：收集釘螺孵育后的超純水，轉(zhuǎn)至離心管中，在1000～5000r/min條件下離心5～20min，棄上層清液，沉淀用血液/細(xì)胞/組織基因組DNA提取試劑盒提取尾蚴基因組DNA，感染性釘螺碾碎，收集螺肉及內(nèi)臟，用軟體動(dòng)物基因組DNA提取試劑盒提取釘螺基因組DNA，提取后的尾蚴基因組DNA和釘螺基因組DNA均置于-20℃?zhèn)溆茫?/p>

步驟三，候選基因確定：選擇日本血吸蟲(chóng)尾蚴期若干個(gè)預(yù)測(cè)蛋白基因作為目的基因；

步驟四，LAMP引物設(shè)計(jì)與合成：依據(jù)Protein ID，在NCBI網(wǎng)站中搜索、下載并保存步驟三中選擇的日本血吸蟲(chóng)尾蚴期的預(yù)測(cè)蛋白核酸序列的TXT文本，利用DNAStar軟件，將核酸序列格式另存為Seq，應(yīng)用軟件http://primerexplorer.jp/elamp4.0.0/index.html在線設(shè)計(jì)LAMP引物；上傳核酸序列，設(shè)置參數(shù)為默認(rèn)值(Automatic Judgment)，設(shè)計(jì)引物(Primer design)，如若未有引物自動(dòng)生成，則修改參數(shù)值中的長(zhǎng)度和Tm值，再次生成LAMP引物；

步驟五，LAMP引物配置(常溫下配置)：

A.引物儲(chǔ)存液配置，將步驟四得到的含有LAMP引物干粉的1.5ml離心管放入離心機(jī)，在12000～16000r/min的條件下離心1～10min，根據(jù)引物干粉物質(zhì)的量溶解干粉，配置內(nèi)引物(FIP/BIP)母液和外引物(F3/B3)母液，配置的母液室溫放置數(shù)分鐘后渦旋儀100～300r/min震蕩混勻，隨后放入離心機(jī)，進(jìn)行離心；

B.引物工作液PM配置：取步驟五A得到的FIP和BIP各4μl、F3和B3各1μl，然后加入10μl超純水制備成20μl工作液備用；

步驟六，尾蚴期及感染性釘螺基因組DNA的LAMP檢測(cè)：

尾蚴期和感染性釘螺基因組25μl LAMP反應(yīng)體系：12.5μl 2×RM反應(yīng)液，1μl步驟四得到的引物工作液PM，1μl步驟二得到的DNA模板，1μl Bst DNA Polymerase，加超純水至25μl，混勻后加20μl密封液再次離心，最后將1μl顯色液滴在PCR管蓋中間，蓋緊管蓋，PCR儀內(nèi)反應(yīng)，終止反應(yīng)后顛倒PCR管數(shù)次，使顯色液和反應(yīng)混合液充分混勻， 短暫離心后觀察反應(yīng)液顏色變化，若呈現(xiàn)綠色則為陽(yáng)性(有核酸擴(kuò)增)，呈現(xiàn)棕紅色則為陰性(無(wú)核酸擴(kuò)增)。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的基于日本血吸蟲(chóng)尾蚴期基因的環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增法，其特征在于：所述步驟二中沉淀用血液/細(xì)胞/組織基因組DNA提取試劑盒為離心柱型。

3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的基于日本血吸蟲(chóng)尾蚴期基因的環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增法，其特征在于：所述步驟三中選擇日本血吸蟲(chóng)尾蚴期16個(gè)預(yù)測(cè)蛋白基因作為目的基因。

4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的基于日本血吸蟲(chóng)尾蚴期基因的環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增法，其特征在于：所述預(yù)測(cè)蛋白基因包括被膜抗原、鈣離子結(jié)合蛋白、尿嘧啶核苷磷酸化酶、多巴胺脫羧酶等的編碼基因和編碼數(shù)個(gè)假定蛋白的基因。

5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的基于日本血吸蟲(chóng)尾蚴期基因的環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增法，其特征在于：所述預(yù)測(cè)蛋白基因分別為：AY813605.1、AY814178.1、AY815661.1、FN314484.1、CNUS0000038.1、CNUS0000099824.1、CNUS0000102858.1、CNUS0000103096.1、CNUS0000103598.1、CNUS0000103614.1、CNUS0000105310.1、CNUS0000105798.1、CNUS0000106268.1、CNUS0000106483.1、CNUS0000107348.1、CNUS0000107429.1。