[發明專利]一種魚卵、仔稚魚分類鑒定的方法

在審

• 申請號: 201710086342.3
• 申請日: 2017-02-17
• 公開（公告）號: CN106834473A
• 公開（公告）日: 2017-06-13
• 發明（設計）人: 朱書禮;李新輝;楊計平;李捷;李躍飛;武智;帥方敏
• 申請（專利權）人: 中國水產科學研究院珠江水產研究所
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68
• 代理公司: 北京華仁聯合知識產權代理有限公司11588
• 代理人: 覃紅麗

技術領域

本發明涉及漁業領域，具體涉及一種魚卵、仔稚魚分類鑒定的方法。

背景技術

魚類早期資源調查是以魚類早期生活史階段為對象進行的資源量調查研究工作，是進行魚類生態學和漁業生物學研究的一個重要手段。魚類早期資源調查可以推算魚類繁殖群體數量，估算補充群體數量，科學地預測魚類種群數量變動，為漁業資源保護和合理開發利用提供科學依據。在早期資源調查過程中，需要對采集的魚卵、仔稚魚進行分類鑒定和數量統計，以往的分類鑒定需要有一定的基礎知識和經驗積累的工作者進行目測和顯微鏡觀察，工作量大，消耗時間長，而且有些種類鑒定準確性不好把握。在魚卵、仔稚魚調查采樣數量較大時，以往的分類鑒定方法就表現出明顯的不足。

發明內容

本發明的目的是為了克服以往分類鑒定方法的不足，提供一種魚卵、仔稚魚分類鑒定的方法。本發明為實現上述目的，采用如下技術方案：

一種魚卵、仔稚魚分類鑒定的方法，包括以下步驟：

(1)采集調查水域的成魚樣本，并對成魚樣本進行分類鑒定，將已分類鑒定的各種魚類提取DNA，并對COⅠ序列分別進行PCR擴增測序，據此建立該調查水域魚類的COⅠ序列數據庫；

(2)將調查采集到的魚卵、仔稚魚樣本編號，用相同方法對魚卵、仔稚魚COⅠ序列進行擴增測序；

(3)將魚卵、仔稚魚COⅠ序列測序結果與已建立的COⅠ序列數據庫進行比對分析，從而鑒定魚卵、仔稚魚的種類。

步驟(1)中所述DNA提取方法為：取成魚新鮮肌肉或鰭條組織，用無水乙醇固定，蛋白酶K消化，酚-仿常規方法抽提DNA，-20℃保存備用。

所述的COⅠ序列通用擴增引物為：Forward primer：

5-TCAACCAACCACAAAGACATTGGCAC-3，Reverse primer：

5-TAGACTTCTGGGTGGCCAAAGAATCA-3。

所述的PCR擴增反應體系為：95℃預變性3分鐘；每一個循環94℃30秒，56℃30秒，72℃50秒，共30個循環；最后72℃延伸6分鐘；PCR產物經1％瓊脂糖凝膠電泳檢測后，用純化試劑盒回收，測序。

本發明在采集魚卵、仔稚魚后僅需用無水乙醇保存，不需要復雜的保存條件，同時選用COⅠ序列這一相對保守的片段建立調查水域魚類COⅠ序列數據庫，對魚卵、仔稚魚相應片段進行擴增測序，然后與COⅠ序列數據庫進行比對分析的方法對調查水域魚卵、仔稚魚進行分類鑒定。該方法鑒定準確度高，消耗時間短，工作量小，克服了以往方法的不足之處，顯示了其快速、準確、高效的優勢。

具體實施方式

本發明為一種魚卵、仔稚魚分類鑒定的方法，采用一下步驟：

1、在調查水域采集成魚樣本，并對成魚樣本進行分類鑒定，取新鮮肌肉或鰭條組織，用無水乙醇固定，蛋白酶K消化，酚-仿常規方法抽提DNA，-20℃保存備用；

2、選擇相對保守的COⅠ序列片段，選用通用擴增引物為：Forward primer：5-TCAACCAACCACAAAGACATTGGCAC-3，Reverse primer：

5-TAGACTTCTGGGTGGCCAAAGAATCA-3；

3、PCR擴增反應體系為：95℃預變性3分鐘；每一個循環94℃30秒，56℃30秒，72℃50秒，共30個循環；最后72℃延伸6分鐘；

4、PCR產物經1％瓊脂糖凝膠電泳檢測后，用純化試劑盒回收，測序；

5、將各種魚類的COⅠ序列匯總，建立COⅠ序列數據庫；

6、在調查水域采集的魚卵、仔稚魚樣本用無水乙醇固定，隨機挑選一部分樣本并編號，按照步驟1所述方法提取DNA并保存于-20℃備用；

7、按照步驟2-4所述實驗程序，測序獲得各魚卵、仔稚魚樣本的COⅠ序列；

8、將已獲得的各魚卵、仔稚魚樣本的COⅠ序列與已建立的COⅠ序列數據庫進行比對分析，對魚卵、仔稚魚樣本進行分類鑒定。