[發明專利]一種腺病毒高免卵黃抗體注射液及其制備方法

在審

• 申請號: 201710084395.1
• 申請日: 2017-02-16
• 公開（公告）號: CN106806891A
• 公開（公告）日: 2017-06-09
• 發明（設計）人: 鄭培培;羅青平;邵華斌;王紅琳;溫國元;張蓉蓉;張騰飛;汪宏才;盧琴;羅玲
• 申請（專利權）人: 湖北省農業科學院畜牧獸醫研究所
• 主分類號: A61K39/395
• 分類號: A61K39/395;A61P31/14;C07K16/08;C07K16/02
• 代理公司: 北京華仲龍騰專利代理事務所(普通合伙)11548
• 代理人: 李靜

技術領域

本發明屬于禽類用生物制品技術領域，具體涉及一種腺病毒高免卵黃抗體注射液及其制備方法。

背景技術

禽腺病毒屬于禽腺病毒科禽腺病毒屬，根據其抗原性的不同可分為3個群，且根據血清中和反應Ⅰ群禽腺病毒包含12個血清型，4型禽腺病毒主要感染3-5周齡雞子，臨床和病理癥狀為心包積液綜合征、包涵體肝炎、腎炎等，致死率30-70％。由于腺病毒4型首次爆發于1987年的巴基斯坦，隨至傳播至印度、日本、墨西哥、智利、中國等一些國家，給養殖業帶來大量損失。大量研究者發現不同的毒株在飼養條件下是同等感染，自然條件或口服接種后病程是7-15天。禽腺病毒是接觸性傳染性疾病，既可以水平傳播，也可以垂直傳播。

心包積液綜合征最初認為是由霉菌毒素、脂肪中毒、多氯聯苯、氯化鈉、藻毒素等引起的中毒或者營養不良導致的，然而根據這些原因治療之后均不能起到有效的治療。隨后研究發現心包積液綜合征是由一個病毒引起的，電子顯微鏡觀察到病毒呈六邊形。后來，人們開始通過雞胚原代肝細胞、雞胚原代腎細胞、雞胚等途徑對病毒開始進行純化增殖，發現感染3-4天后其可視細胞變圓、腫脹、脫落，感染的雞胚會生長受阻、出血點、100％死亡。近年來，心包積液和包涵體肝炎在全世界爆發率增加，給養殖業帶來大量損失。

目前，大量學者嘗試各種方法來預防腺病毒帶來的危害，最開始是用發病雞的組織來免疫雞子，但是這種方法可能導致病毒的傳播，后來學者發明了腺病毒滅活苗、亞單位疫苗、弱毒疫苗。卵黃抗體IgY是一種免疫球蛋白Ig，功能上類似于哺乳動物的IgG，但是結構上有所差異，具有典型的免疫球蛋白的空間構象。卵黃抗體具有很多優點：1)卵黃抗體不會激發補體系統，不與抗哺乳動物抗原的抗體反應，且不與哺乳動物和細菌的Fc受體結合；2)卵黃抗體作為一種具有生物活性的免疫球蛋白，在貯存、生產、加工、攝食及消化過程中保證其穩定性是非常關鍵的。多項實驗表明IgY具有較好的穩定性，耐酸、耐堿、耐熱。卵黃抗體較易保存，4℃條件下存放5年或室溫條件下存放6個月對抗體活性無明顯影響；3)卵黃抗體量大，成本低，便于規模化生產。卵黃中抗體濃度能長期維持在相當于甚至超過血清抗體濃度的水平上。且卵黃抗體對動物沒有毒副作用。目前卵黃抗體的制備及生產工藝已經成熟，可以保質保量的生產。

發明內容

為了解決現有技術存在的不足，本發明提供一種腺病毒高免卵黃抗體注射液及其制備方法。

其技術方案為：

一種腺病毒高免卵黃抗體注射液，雞卵黃中含有水分48％，蛋白質17.8％和脂肪30.5％，其他3.7％，卵黃蛋白包括水溶性蛋白(α-卵黃球蛋白、β-卵黃球蛋白、γ-卵黃球蛋白，其中γ-卵黃球蛋白即是IgY)和各種脂蛋白。本研究制備卵黃抗體的過程采用了粗提卵黃免疫球蛋白的措施，其主要目的是除去卵黃中的非水溶性成分。經過PEG處理，該高免卵黃注射液的主要包含水分、蛋白質，蛋白質成分占據約30％，水分70％。

一種腺病毒高免卵黃抗體注射液的制備方法，包括以下步驟：

步驟1、分離毒株制備疫苗：樣品經過研磨，凍融3次，12000g/min告訴離心8min，吸取上清液，將上清液接種到雞胚尿囊腔，經過3代的傳遞，根據雞胚的病變和PCR檢測情況，驗證得到弱毒株XH03；

步驟2、免疫健康雞群制得蛋：采用自備的雞腺病毒滅活苗對健康21只進行免疫，免疫兩次，間隔兩周，一周后開始收集蛋，清理、消毒、晾干備用；

步驟3、將收集好的雞蛋表面污物洗干凈，在0.4％的新潔爾滅溶液中浸泡15min；取出后用消毒紗布擦干，從小頭打破蛋殼后倒盡蛋清；用不帶針頭的1ml無菌注射器插入蛋黃中，吸取500ul放入高壓滅菌過的2ml離心管內，加入1ml PBS緩沖液，即卵黃：PBS以1:2的比例稀釋；在卵黃液中加入青、鏈霉素各1000單位/ml；按0.01％加入硫柳汞，以防止微生物污染；在漩渦混勻器上充分混合均勻，并用封口膜封口，放置4℃備用；

步驟4、高免卵黃抗體的提取

1)用PBS稀釋卵黃液，體積比為2:1，用PEG-6000配成3.5％的PEG溶液，混合均勻，靜置20min，4℃，14000rpm離心10min；

2)棄去上清液和脂肪層。添加PEG-6000，配成12％的PEG溶液，混合均勻，靜置20min。4℃，14000rpm離心10min。

3)棄去上清液，用PBS稀釋沉淀至原卵黃液體積。然后添加PEG-6000，配成12％(w/v)的PEG溶液，混合均勻，靜置20min。4℃，14000rpm離心10min。