[發明專利]適用于家蠶細胞雙熒光素酶報告基因系統的內參質粒及其制備方法和應用

無效

• 申請號: 201710084001.2
• 申請日: 2017-02-16
• 公開（公告）號: CN106701766A
• 公開（公告）日: 2017-05-24
• 發明（設計）人: 夏慶友;劉紅玲;林英;沈關望
• 申請（專利權）人: 西南大學
• 主分類號: C12N15/113
• 分類號: C12N15/113;C12N15/85;C12N15/65;C12N15/66
• 代理公司: 北京同恒源知識產權代理有限公司11275
• 代理人: 趙榮之

技術領域

本發明屬于生物技術領域，具體涉及適用于家蠶細胞雙熒光素酶報告基因系統的內參質粒，還涉及該內參質粒的制備方法和應用。

背景技術

雙熒光素酶報告基因系統廣泛應用于細胞水平的遺傳毒性檢測、信號通路研究、轉錄活性分析等。即在一個信號系統(通常為細胞)內同時表達兩個熒光素酶報告基因，其表達的兩個熒光素酶的活性能夠獨立測定。在雙報告基因系統中，一個報告基因活性的改變，與基因表達的特定實驗條件相關，而另一個報告基因的組成型活性則提供內對照(內參)，使實驗值正態化。與傳統的共報告基因CAT、β-Gal、GUS相比，雙熒光素酶報告系統更加靈敏，能把削弱實驗準確性的內在因素降到最低，而且檢測時間更加快速。

但雙熒光素酶報告基因系統需要內參的組成型活性，需要內參啟動子在系統中能夠組成型表達。目前哺乳動物細胞中使用的內參載體：如PRL-CMV，PRL-SV40，PRL-TK等已經商業化。然而并非所有組成型啟動子的活性都不受外界因素影響，事實上一般的組成型表達都是相對的，并非所有系統所有條件下的表達都不變：濮軍等人研究發現活化T細胞核因子能夠調控SV40啟動子的活性；有些雙熒光素酶報告基因系統內參如PRL-SV40在果蠅細胞中不表達，不能適用于果蠅細胞系。所以，針對不同物種的細胞系選擇合適的內參載體成了雙熒光素酶報告基因系統準確運用的關鍵。

目前家蠶細胞中使用的雙熒光素酶報告基因系統常用內參除了PRL-CMV，PRL-SV40，PRL-TK等，還有p-IE1-Rlucp，但PRL-CMV，PRL-SV40，PRL-TK等載體在家蠶細胞中表達的RLUC酶活相對較低，一般轉染0.1μg測得的酶活性數值僅為幾十到一百之間，常用酶標儀測定酶標板上空白孔的讀數就在40左右，加之該系列的內參質粒在家蠶細胞中活性不穩定；p-IE1-Rlucp內參在家蠶細胞中可穩定表達，但一般轉染0.1μg測得RLUC酶活數值又過高，可達10⁴到10⁶，這樣在計算得到的相對熒光素酶活性的值很低，不適宜低活性的啟動子的細胞水平研究。

家蠶是重要的經濟昆蟲，遺傳背景清楚，遺傳資源豐富，是國際公認鱗翅目研究的模式昆蟲。對家蠶中具有組織/時空特異性甚至表達條件誘導型基因的啟動子開發，能為家蠶生物反應器、遺傳育種和鱗翅目害蟲防治以及推動昆蟲分子生物學研究等提供有利的工具和思路。為此，選用一種家蠶細胞中穩定表達的雙熒光素酶報告基因系統的內參質粒顯得尤為重要。

發明內容

有鑒于此，本發明的目的在于提供一種適用于家蠶細胞雙熒光素酶報告基因系統的組成型啟動子BmVgP78M，本發明的目的之二在于提供含有所述組成型啟動子BmVgP78M的內參質粒；本發明的目的之三在于提供內參質粒的制備方法；本發明的目的之四在于提供內參質粒在制備家蠶雙熒光素酶報告基因系統中的應用。

為達到上述目的，本發明提供如下技術方案：

1、適用于家蠶細胞雙熒光素酶報告基因系統的組成型啟動子BmVgP78M，所述組成型啟動子BmVgP78M的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示。

2、含有所述組成型啟動子BmVgP78M的內參質粒。

優選的，所述內參質粒由BmVgP78M啟動子連入PRL-SV40質粒BglⅡ和NheI限制性內切酶而得。

3、所述內參質粒的制備方法，包括如下步驟：以SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6為引物，含有SEQ ID NO.4所示序列的載體為模板進行PCR擴增，然后將擴增產物用BglⅡ和NheI酶切后連入經同樣酶切的PRL-SV40質粒。

優選的，所述PCR擴增的條件為94℃預變性4分鐘；94℃變性30秒，55℃退火30秒，72℃延伸10秒，共30個循環；最后72℃延伸10分鐘，4℃保存。

優選的，所述含有SEQ ID NO.4所示序列的載體由以下方法制得：以家蠶品種大造成蟲基因組為模板，SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3所示序列為引物進行PCR擴增，然后將擴增產物連入pMD-19T simple載體即可。

4、所述內參質粒在制備家蠶雙熒光素酶報告基因系統中的應用。

本發明的有益效果在于：本發明通過將BmVg基因啟動子激素元件突變后獲得能夠在家蠶中不受激素應答穩定表達且表達量適中，可有效的作為家蠶細胞中使用雙熒光素酶報告基因系統研究啟動子活性或基因調控的內參質粒。

附圖說明

為了使本發明的目的、技術方案和有益效果更加清楚，本發明提供如下附圖進行說明：