[發(fā)明專利]一種經(jīng)鼻腔給藥用于帕金森病治療的神經(jīng)干細胞制劑

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 201710083760.7
• 申請日: 2017-02-16
• 公開（公告）號: CN106924286A
• 公開（公告）日: 2017-07-07
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 趙雄飛;鄭佳威;黃倩瑩
• 申請（專利權(quán)）人: 上海安集協(xié)康生物技術(shù)股份有限公司
• 主分類號: A61K35/30
• 分類號: A61K35/30;A61K9/00;C12N5/0797;A61P25/16
• 代理公司: 上海伯瑞杰知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司31227
• 代理人: 曹莉

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及屬于生物醫(yī)藥領(lǐng)域，具體涉及一種經(jīng)鼻腔給藥用于帕金森病治療的神經(jīng)干細胞制劑及其制備方法及應用。

背景技術(shù)

帕金森病(Parkinson’s disease，PD)是臨床上較為常見的難治病癥，以黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元變性缺失以及路易小體形成為主要病理特點，臨床表現(xiàn)主要為靜止性震顫、運動遲緩、肌強直和姿勢步態(tài)異常，極大影響了患者的生存質(zhì)量。從19世紀60年代晚期開始，通過口服左旋多巴的多巴胺替代療法來緩解PD運動癥狀是現(xiàn)代神經(jīng)科學轉(zhuǎn)化研究中的成功之一。目前，左旋多巴仍是治療有癥狀PD的金標準。PD治療目前最為有效的方法是采用左旋多巴替代治療，但仍不能有效阻止或減緩疾病的發(fā)展。目前只能采用藥物、外科手術(shù)或電極的方式進行緩解和控制癥狀，避免發(fā)展速度過快。

自二十世紀八十年代初開展的細胞移植治療PD以來，人們已嘗試過胚胎中腦黑質(zhì)組織、自體腎上腺髓質(zhì)，胚胎干細胞、神經(jīng)干細胞、骨髓干細胞、人畸胎瘤神經(jīng)元等，并取得了一定的療效，因此細胞移植治療PD也越來越多的受到關(guān)注。但上述細胞來源均受供體(donors)資源匱乏、倫理問題、成瘤風險大、免疫排斥反應、誘導多巴胺能神經(jīng)元比例低等問題困擾，限制了細胞移植治療帕金森病的進程。

目前臨床治療帕金森病的方法以口服DA前體藥物左旋多巴為主，但這種藥物起初有效，長期服用則會出現(xiàn)療效下降，并引起一系列運動障礙并發(fā)癥。外科治療以蒼白球和丘腦的損毀為主要方法，但術(shù)后復發(fā)率高。上述方法屬于對癥治療，但不能逆轉(zhuǎn)DA能神經(jīng)元的變性，因此，找到一種能夠替代變性的多巴胺能神經(jīng)細胞以恢復多巴胺神經(jīng)遞質(zhì)功能的新技術(shù)新方法，已成為迫在眉睫的需求。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的在于克服上述現(xiàn)有技術(shù)存在的不足，提供一種經(jīng)鼻腔給藥用于帕金森病治療的神經(jīng)干細胞制劑及其制備方法及應用。

本發(fā)明與鼠神經(jīng)生長因子等神經(jīng)營養(yǎng)藥不同，神經(jīng)干細胞注射液來源自人類胚胎(通過倫理審查)，完全100％人源，并且采用鼻腔無創(chuàng)給藥的方式，直接作用于中樞神經(jīng)系統(tǒng)，預計對小兒腦癱將有更好的療效。

本發(fā)明的目的是通過以下技術(shù)方案來實現(xiàn)的：

本發(fā)明涉及一種經(jīng)鼻腔給藥用于帕金森病治療的神經(jīng)干細胞制劑，所述方法包括如下步驟：

S1：種子細胞培養(yǎng)與純化：將原代神經(jīng)干細胞用無血清培養(yǎng)基對細胞懸液進行培養(yǎng)擴增傳代至P5代即為獲得的種子細胞。

原代神經(jīng)干細胞可以是在顯微鏡下使用手術(shù)器械分離獲得廢棄胎腦的腹側(cè)中腦組織，然后采用消化液將細胞進行消化，細胞計數(shù)后使用無血清完全培養(yǎng)基進行重懸，并接種于超低吸附培養(yǎng)瓶中，35℃5％CO2培養(yǎng)箱中進行懸浮培養(yǎng)，每間隔48-72小時進行換液，細胞連續(xù)培養(yǎng)12天左右即可傳代，連續(xù)培養(yǎng)至P5代，在P0代到P5代這個過程里，所得的細胞越來越純。將所得的P0-P5代細胞放入種子細胞庫中進行存儲。

本發(fā)明所述神經(jīng)干細胞可以是不同動物例如哺乳動物例如靈長類動物例如人、嚙齒類動物例如鼠等的神經(jīng)干細胞，而且所述神經(jīng)干細胞可以得自不同來源，例如可以商購獲得的神經(jīng)球凍存液或神經(jīng)干細胞細胞系，或者是間充質(zhì)干細胞向神經(jīng)方向誘導獲得的神經(jīng)干細胞；或者是由其他來源經(jīng)誘導分化而來的神經(jīng)干細胞，比如iPSC技術(shù)，胚胎干細胞(包括極小類胚胎干細胞)，亞全能干細胞，人類視網(wǎng)膜色素上皮細胞等；或者是除神經(jīng)組織器官以外的其他器官及組織而來的神經(jīng)干細胞，比如臍帶血和臍帶。

S2：P6—P8代細胞培養(yǎng)：將步驟S1中得到的P5代神經(jīng)干細胞用無血清培養(yǎng)基對細胞懸液進行培養(yǎng)擴增傳代至P8代。

所述培養(yǎng)擴增傳代的方法為將細胞培養(yǎng)瓶采用層粘連蛋白Laminin在37℃包被2小時，然后采用不含Ca、Mg的DPBS洗滌一遍備用；將P5代神經(jīng)干細胞消化計數(shù)后，采用無血清完全培養(yǎng)基進行重懸，并調(diào)整密度為1x10⁵個/ml，接種于包被好的培養(yǎng)瓶中，置于35℃5％CO2環(huán)境進行貼壁培養(yǎng)；細胞培養(yǎng)每間隔48小時進行換液，細胞連續(xù)培養(yǎng)7天左右即可傳代，直至P8代，期間P6-P8細胞放入主細胞庫進行存儲。

S3：工作細胞庫：取步驟S2中P8代細胞，進行細胞特性和異源物質(zhì)檢測，檢測合格后，即為工作細胞，將其進行消化凍存，并轉(zhuǎn)移至工作細胞庫待用。

優(yōu)選的，步驟S2中所述無血清培養(yǎng)基是由DMEM/F12，B27，N2，以及神經(jīng)營養(yǎng)因子BFGF,EGF,LIF組成，無任何動物源血清成分。