[發(fā)明專利]基于數(shù)字PCR鑒定純合型和雜合型轉(zhuǎn)基因玉米雙抗12-5的方法及應(yīng)用

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201710083147.5
• 申請日: 2017-02-16
• 公開（公告）號: CN106755519B
• 公開（公告）日: 2021-02-12
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 徐曉麗;汪小福;徐俊鋒;彭城;陳笑蕓;魏巍
• 申請（專利權(quán)）人: 浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院
• 主分類號: C12Q1/6851
• 分類號: C12Q1/6851;C12Q1/6895
• 代理公司: 北京超凡志成知識產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(普通合伙) 11371
• 代理人: 齊云

本發(fā)明提供了一種基于數(shù)字PCR鑒定純合型和雜合型轉(zhuǎn)基因玉米雙抗12?5的方法及應(yīng)用，該方法為提取待測樣品的DNA進行PCR擴增，根據(jù)所述PCR擴增的熒光信號值計算所述待測樣品中外源基因與內(nèi)參基因的拷貝數(shù)比值，并根據(jù)所述拷貝數(shù)比值判斷所述待測樣品為純合型還是雜合型轉(zhuǎn)基因玉米雙抗12?5。該方法為轉(zhuǎn)基因玉米雙抗12?5的雜交育種及標準物質(zhì)或原材料的鑒定繁殖工作奠定了基礎(chǔ)，保障材料背景的真實可靠。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及轉(zhuǎn)基因檢測技術(shù)領(lǐng)域，尤其是涉及一種基于數(shù)字PCR鑒定純合型和雜合型轉(zhuǎn)基因玉米雙抗12-5的方法及應(yīng)用。

背景技術(shù)

在采用轉(zhuǎn)基因技術(shù)進行育種的過程中，首先要將目標基因?qū)胧荏w植物中，一般來說，植物轉(zhuǎn)化采用的受體品種都不是適宜商業(yè)化的品種，而是采用一些容易轉(zhuǎn)化的品種，因此獲得轉(zhuǎn)基因植株后需要通過雜交的方法將轉(zhuǎn)基因性狀導(dǎo)入適宜商業(yè)化生產(chǎn)的品種中。在這一過程中，鑒定植物材料的純合度是一項非常重要的工作。另外進行轉(zhuǎn)基因生物及產(chǎn)品成分檢測的一個重要的物質(zhì)基礎(chǔ)是轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品檢測標準物質(zhì)的獲取，而原材料純合度鑒定是制備標準物質(zhì)的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。目前對轉(zhuǎn)基因植物進行純合度鑒定通常采用的方法是將轉(zhuǎn)基因植物材料進行自交或者與非轉(zhuǎn)基因植株進行雜交，通過分析后代的性狀分離進行鑒定，但是，這種鑒定方法需要花費大量的時間同時工作量也非常的大。

German等建立了實時熒光定量PCR的方法對轉(zhuǎn)基因植物進行純合度鑒定。實時熒光定量PCR方法有許多優(yōu)勢，比如快速、靈敏，但是在鑒定轉(zhuǎn)基因植物的純合度方面其精確性一直受到質(zhì)疑，因為純合性的鑒定要求能夠?qū)D(zhuǎn)基因的拷貝數(shù)達到精確區(qū)分2倍的差距的要求。采用實時熒光定量PCR的方法進行純合度鑒定必須首先要建立標準曲線，從而確保靶標基因和內(nèi)參基因反應(yīng)的效率一致或非常接近。為了達到需要的精確度，要篩選優(yōu)化引物，使其反應(yīng)效率達到或接近100％，同時要采用高質(zhì)量的定量PCR預(yù)混試劑和高質(zhì)量的DNA。另外，這種方法需要一個已知純合度的樣品作為校準材料。因此，實時熒光定量PCR法通常是作為其它方法的補充。

數(shù)字PCR技術(shù)作為第三代PCR，具有不通過建立標準曲線就能夠?qū)Π袠撕怂徇M行直接定量的性能。目前有兩種不同類型的數(shù)字PCR技術(shù)：微流體數(shù)字PCR和微滴數(shù)字PCR。在數(shù)字PCR中，采用微流體或微滴化方法，將大量稀釋后的核酸溶液分散至芯片的微反應(yīng)器或微滴中。這樣經(jīng)過PCR循環(huán)之后，有核酸分子模板的反應(yīng)器或微滴就會給出熒光信號，沒有模板的反應(yīng)器或微滴就沒有熒光信號。根據(jù)相對比例和反應(yīng)器或微滴的體積，就可以推算出原始溶液的核酸濃度。數(shù)字PCR具有與實時熒光定量PCR相似的快速、靈敏的優(yōu)點，同時，它具有對反應(yīng)抑制物較強的耐受力(Hindson et al.,2013)。兩種數(shù)字PCR技術(shù)均已被用于臨床診斷、單細胞基因表達和環(huán)境微生物檢測等研究中，在轉(zhuǎn)基因成分定量方面也多有報道，Glowacka等近期報道了采用數(shù)字PCR技術(shù)對轉(zhuǎn)基因煙草進行拷貝數(shù)和純合度分析，結(jié)果顯示數(shù)字PCR技術(shù)與Southern雜交法相比具有相同的可靠性同時更加快速。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的在于提供一種基于數(shù)字PCR鑒定純合型和雜合型轉(zhuǎn)基因玉米雙抗12-5的方法，為轉(zhuǎn)基因玉米雙抗12-5的雜交育種及標準物質(zhì)或原材料的鑒定繁殖工作奠定基礎(chǔ)，保障材料背景的真實可靠。

為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案：

一種基于數(shù)字PCR鑒定純合型和雜合型轉(zhuǎn)基因玉米雙抗12-5的方法，提取待測樣品的DNA進行PCR擴增，根據(jù)所述PCR擴增的熒光信號值計算所述待測樣品中外源基因與內(nèi)參基因的拷貝數(shù)比值，并根據(jù)所述拷貝數(shù)比值判斷所述待測樣品為純合型還是雜合型轉(zhuǎn)基因玉米雙抗12-5。

優(yōu)選地，內(nèi)參基因的PCR引物序列如下：

adh1-F:5'-CGTCGTTTCCCATCTCTTCCTCC-3'(SEQ ID NO.1)

adh1-R:5'-CCACTCCGAGACCCTCAGTC-3'(SEQ ID NO.2)。