[發明專利]基于數字PCR鑒定純合型和雜合型轉基因玉米雙抗12-5的方法及應用

有效

• 申請號: 201710083147.5
• 申請日: 2017-02-16
• 公開（公告）號: CN106755519B
• 公開（公告）日: 2021-02-12
• 發明（設計）人: 徐曉麗;汪小福;徐俊鋒;彭城;陳笑蕓;魏巍
• 申請（專利權）人: 浙江省農業科學院
• 主分類號: C12Q1/6851
• 分類號: C12Q1/6851;C12Q1/6895
• 代理公司: 北京超凡志成知識產權代理事務所(普通合伙) 11371
• 代理人: 齊云

1.一種基于數字PCR鑒定純合型和雜合型轉基因玉米雙抗12-5的方法，其特征在于，提取待測樣品的DNA進行PCR擴增，根據所述PCR擴增的熒光信號值計算所述待測樣品中外源基因與內參基因的拷貝數比值，并根據所述拷貝數比值判斷所述待測樣品為純合型還是雜合型轉基因玉米雙抗12-5；

內參基因的PCR引物序列如下：

adh1-F:5'-CGTCGTTTCCCATCTCTTCCTCC-3'(SEQ ID NO.1)；

adh1-R:5'-CCACTCCGAGACCCTCAGTC-3'(SEQ ID NO.2)；

內參基因的PCR探針序列如下：

adh1-pro:5'-FAM-AATCAGGGCTCATTTTCTCGCTCCTCA-3'-BHQ1(SEQ ID NO.3)；

外源基因的PCR引物序列如下：

qSK12-5F:5′-GTCGTTTCCCGCCTTCAGTT-3′(SEQ ID NO.4)；

qSK12-5R:5′-GGTGCCTGGAAGACAAGTTCTA-3′(SEQ ID NO.5)；

外源基因的PCR探針序列如下：

qSK12-5P：5′-FAM-AGCTCAACCACATCGCCCGACGC-3'-BHQ1(SEQ ID NO.6)；

根據所述拷貝數比值判斷所述待測樣品為純合型還是雜合型轉基因玉米雙抗12-5為通過泊松分布公式計算出所述待測樣品中外源基因與內參基因的拷貝數，外源基因拷貝數記為：Ne，內參基因拷貝數記為：Ni；通過Ne/Ni的值來判定樣品為純合型或雜合型，若Ne/Ni的值接近0.5，相對偏差25％，則樣品為雜合型，若Ne/Ni的值接近1.0，相對偏差25％，則樣品為純合型。

2.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，所述內參基因的PCR反應體系以20μL計為：

2×ddPCR Supermix for probe，10μL；引物adh1-F的終濃度為0.9μM；引物adh1-R的終濃度為0.9μM；探針adh1-pro的終濃度為0.25μM；DNA模板，2μL；總反應體系為20μL。

3.根據權利要求2所述的方法，其特征在于，所述PCR反應條件為：95℃預變性10min；95℃變性30sec,60℃退火及延伸45sec,共40個循環；98℃10min,4℃保存，升降溫速度保持在2℃/秒。

4.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，所述外源基因PCR反應體系以20μL計為：

2×ddPCR Supermix for probe，10μL；引物qSK12-5F的終濃度為0.9μM；引物qSK12-5R的終濃度為0.9μM；探針qSK12-5P的終濃度為0.25μM；DNA模板，2μL；總反應體系為20μL。

5.根據權利要求4所述的方法，其特征在于，所述PCR反應條件為：95℃預變性10min；95℃變性30sec，60℃退火及延伸45sec，共40個循環；98℃10min，4℃保存，升降溫速度保持在2℃/秒。

6.如權利要求1所述的方法在轉基因玉米雙抗12-5的雜交育種及標準物質或原材料的鑒定中的應用。