[發明專利]一種大分子DNA的體外無縫組裝方法

有效

• 申請號: 201710082579.4
• 申請日: 2017-02-15
• 公開（公告）號: CN106893750B
• 公開（公告）日: 2020-07-28
• 發明（設計）人: 余東;袁定陽;段美娟;孫忠志;譚炎寧;孫學武;袁隆平
• 申請（專利權）人: 湖南雜交水稻研究中心;湖南農業大學
• 主分類號: C12P19/34
• 分類號: C12P19/34;C12N15/10
• 代理公司: 深圳市興科達知識產權代理有限公司 44260
• 代理人: 王翀

本發明提供了一種大分子DNA的體外無縫組裝方法，能通過“分段+分步酶促組裝”模式實現大分子DNA的無縫組裝的目標的方法，其有益效果在于：1、利用拼接堿基將大片段DNA分子分成若干個小片段，降低了PCR的難度，并由于拼接堿基的存在實現了分步無縫組裝的目標。2、與傳統的酶切連接方法相比，本發明不依賴于連接，幾乎不受到酶切位點的限制。3、克服了傳統酶切連接方法和位點特異性重組方法容易引入額外堿基的缺點，實現了分步無縫連接的目的。4、本發明的方法比多個片段一步克隆酶促組裝具有更可控的組裝成功率和更高的序列準確率。

技術領域

本發明涉及DNA的體外重組技術領域，具體涉及一種大分子DNA的無縫分步組裝連接的方法。

背景技術

通過DNA體外重組技術合成大分子DNA片段在基因功能研究上的需求越來越多。大片段合成的一個最基本的要求就是將多個小的DNA片段按照一定的方向和精確的堿基順序組裝在一起形成較大的DNA分子。傳統的方法依賴于限制性內切酶的酶切和DNA連接酶的連接。在載體構建中，這種方法一般適用于小于3kb的DNA片段的插入，一旦插入的DNA分子過大，常常會導致沒有合適的酶切位點用來連接插入片段和載體，如果用稀有酶切位點來分段酶切和連接，又會引入不需要的酶切位點堿基，破壞了原來DNA序列的結構。位點特異性重組是一種不依賴于酶切位點的活體內重組方法，該方法依賴于小范圍同源序列的聯會，重組也只發生在兩個特異的同源短序列的范圍之內，但該方法如果應用于大分子DNA序列的分段組裝同樣也會在原來序列中引入重組所必須的特異位點堿基，這些特異位點堿基也破壞了原來DNA序列的結構。為了不破壞DNA序列的原有結構，研究人員又開發了一種不依賴連接(ligation-independent cloning，LIC)的克隆方法。LIC方法中，線性化的骨架質粒可以通過酶切或PCR獲得，插入片段一般通過PCR獲得，在設計插入片段的引物時，使線性化的質粒片段與插入片段之間具有15-35bp的同源末端，同源末端在核酸外切酶的作用下特異切割DNA的5’端序列產生互補配對的單鏈末端，通過退火使互補配對的單鏈末端兩兩結合在一起，再在DNA聚合酶作用下在形成有單堿基缺口的不穩定的環狀DNA分子，將環狀DNA分子轉化到大腸桿菌后，可以在大腸桿菌體內修復缺口形成完整的環狀質粒。該方法在兩種酶的作用下，可以將多個片段一次組裝到質粒中而不破壞原來DNA序列的結構，因此LIC方法又被稱為一步克隆無縫酶促組裝。由于酶促組裝方法能一次無縫組裝兩個以上的片段，具有靈活，省時和省工的優勢，使得該方法有逐步替代傳統的酶切-連接方法的趨勢，市場上也已經出現了多種商業化試劑盒，比如國外的GibsonCloning Kit、HD Cloning Kit和國內北京全式金的pEASY-Uni Seamless Cloning andAssembly Kit等。然而，在實際應用中一步克隆酶促組裝法的成功率極易受組裝片段數目的影響，Nick S.Berrow等報道一個質粒骨架片段和一個插入片段即兩個片段的一步克隆酶促組裝的成功率大于60％，一個質粒骨架片段和兩個插入片段即三個片段的一步組裝的成功率低于40％，而三個以上片段的一步酶促組裝的成功率小于10％，即使在三個以上片段的一步組裝反應中能獲得幾個組裝成功的質粒，但往往由于被組裝的DNA序列片段過長導致PCR過程中容易引入堿基錯配，使得實驗功虧一簣。因此，三個以上片段的一步酶促組裝很難得到序列完全正確的組裝質粒。由于兩個片段酶促組裝的成功率遠大于三個及以上片段的一步酶促組裝成功率，因此也可以將大分子DNA片段隨機分成多個小片段，采用“兩片段酶促組裝+多個酶促反應步驟”的模式將長鏈DNA片段克隆到質粒上，這種模式不僅極大地提高了酶促組裝的成功率，而且可以在第一個小片段組裝成功后立即測序，獲得序列完全正確的組裝產物后再進行下一個片段的組裝，更容易獲得序列完全正確的最終酶促組裝產物。但這種模式的酶促組裝需要在上一次組裝成功后恢復一個酶切位點用于產生下一次酶促組裝的裝配入口，同時被恢復的酶切位點的堿基序列又不能破壞原有的DNA序列結構。目前還沒有相關的方法報導能通過“分段+分步酶促組裝”模式實現大分子DNA的無縫組裝的目標。

發明內容

本發明要解決的技術問題是克服現有技術的不足，提供一種能通過“分段+分步酶促組裝”模式實現大分子DNA的無縫組裝的目標的方法。