[發明專利]一種大分子DNA的體外無縫組裝方法

有效

• 申請號: 201710082579.4
• 申請日: 2017-02-15
• 公開（公告）號: CN106893750B
• 公開（公告）日: 2020-07-28
• 發明（設計）人: 余東;袁定陽;段美娟;孫忠志;譚炎寧;孫學武;袁隆平
• 申請（專利權）人: 湖南雜交水稻研究中心;湖南農業大學
• 主分類號: C12P19/34
• 分類號: C12P19/34;C12N15/10
• 代理公司: 深圳市興科達知識產權代理有限公司 44260
• 代理人: 王翀

1.一種大分子DNA的無縫分步組裝連接的方法，其特征在于，包括如下步驟：

步驟一）分析被組裝序列的酶切位點，獲得不出現在被組裝序列中的限制性內切酶的酶切位點并選擇其中一個限制性內切酶作為組裝酶；組裝酶酶切載體使載體線性化后，線性化載體兩個末端所殘留的部分酶切位點識別序列分別作為該組裝酶的兩個拼接堿基，根據兩個拼接堿基在被組裝序列中的分布情況選用合適的拼接堿基并根據所選用的拼接堿基確定對應的組裝方向；

步驟二）選擇合適數目的拼接堿基將被組裝序列分為兩個或兩個以上DNA組裝片段；設計一套PCR擴增DNA組裝片段的重疊引物對；所述重疊引物包括重疊序列和片段特異序列；重疊序列為與相鄰片段同源的序列，重疊序列的長度為15-25bp；重疊引物對中的一條引物中的特異片段序列包含拼接堿基，該拼接堿基能與重疊序列中相鄰的堿基拼接出一個新的所述組裝酶的酶切位點；另一條引物不含有拼接堿基序列而消除了一個的組裝酶酶切位點；

步驟三）用組裝酶線性化骨架載體，用步驟二設計的重疊引物對進行PCR擴增，獲得所需要的組裝片段；回收酶切獲得的線性化骨架載體和PCR獲得的組裝片段，并通過粘性末端酶的酶促組裝反應將第一個片段裝配到骨架載體中；所述粘性末端酶為核酸外切酶；

步驟四）重復步驟三，根據確定的組裝連接順序將DNA組裝片段分步組裝到骨架載體上，形成最終所需要的載體。

2.如權利要求1所述的大分子DNA的無縫分步組裝連接的方法，其特征在于，步驟一所述組裝酶為限制性內切酶；每一限制性內切酶對應兩個特定的拼接堿基；每一拼接堿基又對應特定的組裝方向，兩個拼接堿基分別對應5′→3′方向和3′→5′方向。

3.如權利要求1所述的大分子DNA的無縫分步組裝連接的方法，其特征在于，步驟一所述組裝方向根據所選用的拼接堿基而確定；同一組裝酶的兩個拼接堿基在被組裝序列中出現的頻率和位置都不同，選擇在被組裝序列中出現頻次高且分布較均勻的拼接堿基。

4.如權利要求1所述的大分子DNA的無縫分步組裝連接的方法，其特征在于，步驟二所述組裝片段的數目根據組裝片段的長度而定，組裝片段的長度為1.5kb-3.5kb。

5.如權利要求1所述的大分子DNA的無縫分步組裝連接的方法，其特征在于，所述特異序列長度為28-35bp，重疊引物的退火溫度等于或大于68℃。

6.如權利要求1所述的大分子DNA的無縫分步組裝連接的方法，其特征在于，步驟三擴增所述組裝片段的PCR反應程序為：①98℃預變性 3min；②5次循環，條件為：98℃ 10s，70℃ 3-5min；30次循環，條件為98℃ 10s，68℃ 3-5min③最后延伸 68℃ 5min ；④4℃保存；所用DNA聚合酶為擴增長片段的高保真DNA聚合酶。

7.如權利要求1所述的大分子DNA的無縫分步組裝連接的方法，其特征在于，步驟三所述酶促組裝反應為：在核酸外切酶的作用下，兩個片段的同源末端形成互補配對的單鏈末端，互補配對的單鏈末端通過退火形成環狀雙鏈，從而使兩個片段連接。