[發明專利]蛋白類藥物中唾液酸的檢測方法

在審

• 申請號: 201710078881.2
• 申請日: 2017-02-14
• 公開（公告）號: CN106908528A
• 公開（公告）日: 2017-06-30
• 發明（設計）人: 邢偉博
• 申請（專利權）人: 信達生物制藥（蘇州）有限公司
• 主分類號: G01N30/02
• 分類號: G01N30/02
• 代理公司: 上海一平知識產權代理有限公司31266
• 代理人: 崔佳佳,劉妍珺

技術領域

本發明涉及質控檢測領域，具體地涉及蛋白類藥物中唾液酸的檢測方法。

背景技術

唾液酸(SA)是一類神經氨酸的衍生物，一個含有9個碳原子并具有吡喃糖結構的酸性氨基糖，系統命名為5-氨基-3,5二脫氧-D-甘油-D-半乳壬酮糖。

根據5號碳上不同的連接基團，構成了不同的唾液酸衍生物。最主要的兩種唾液酸為5-乙酰氨基-3,5-二脫氧-D-半乳壬酮糖(NANA，Neu5Ac，N-乙酰神經氨酸)和3-脫氧-D-甘油-D-半乳壬酮糖(KDN)，其余的唾液酸均是由這兩種衍生而成。而N-羥乙酰神經氨酸(NGNA)是NANA的乙酰基位置上發生了羥基化而得到的。NGNA和NANA通常以低聚糖，糖脂或者糖蛋白的形式存在。

唾液酸修飾與蛋白類藥物的安全性及有效性息息相關，對唾液酸進行準確定量監測既能監控生產工藝的穩定性，同時又利于藥物的質量控制。

目前唾液酸檢測方法主要分為兩類，第一種參考藥典方法，取適量蛋白樣品，加入一定濃度的硫酸或其他酸性試劑，高溫條件下將唾液酸水解，之后離心取上清采用陰離子交換色譜柱進行分離紫外檢測，進行定量。這種方法靈敏度較低，對于目前的藥物蛋白具有很大的局限性，僅能對一些唾液酸含量高的融合蛋白進行檢測。對于唾液酸含量較少的蛋白無法準確定量，尤其對于占據生物藥市場半壁江山的抗體類藥物無法采用該方法進行唾液酸準確定量。

第二種方法為采用DMB(4,5-亞甲二氧基-1,2-苯二胺二鹽酸鹽)熒光標記，采用反相色譜柱，流動相選擇ACN/MeOH/H₂O9/7/84等度分離，之后激發波長373nm，發射波長448nm檢測外標定量。然而，該方法不僅成本高，而且存在以下缺點：1)處理后的樣品含有干擾物質(如無法徹底去除蛋白)，會顯著縮短色譜柱的壽命；(2)即使采用離心方式也無法充分去除蛋白，而采用溶劑處理，則會在色譜分離時產生溶劑效應；(3)每次樣品分析后需要較長時間的色譜柱沖洗；(4)標記試劑與雜質峰可能會影響唾液酸分離及鑒定，標準品保留時間會發生漂移，重現性不好，方法的耐受性較差。

綜上所述，本領域尚缺乏令人滿意的高準確性和高靈敏度的對蛋白類藥物中唾液酸進行檢測的方法。因此，本領域迫切需要開發新的、高準確性和高靈敏度的對蛋白類藥物中唾液酸進行檢測的方法。

發明內容

本發明的目的在于提供一種高準確性和高靈敏度的對蛋白類藥物中唾液酸進行檢測的方法。

在本發明的第一方面，提供了一種對蛋白的唾液酸含量進行檢測的方法，包括步驟：

(1)提供一待分析樣品，其中含有待分析蛋白；

(2)對步驟(1)中的樣品進行酸水解，得到酸水解產物；

(3)對(2)中所述的酸水解產物用標記試劑進行標記，獲得經標記的混合物；

(4)用有機溶劑對所述經標記的混合物進行色譜預處理，獲得預處理的混合物；

(5)將所述預處理的混合物上樣于親水相互作用色譜柱，進行色譜分離，獲得含標記的唾液酸的洗脫液；

(6)對所述的洗脫液進行檢測，從而獲得所述蛋白的唾液酸含量的測定結果。

在另一優選例中，所述方法的唾液酸檢測信噪比大于3(如3-500，較佳地3-200，更佳地4-50，較佳地5-20)。

在另一優選例中，所述步驟(6)中，包括對將樣品的檢測結果與標準曲線或標準品進行比較，從而獲得所述蛋白的唾液酸含量的測定結果。

在另一優選例中，所述的樣品體積≥25微升，如25-2000微升，較佳地50-1500微升。

在另一優選例中，所述的樣品中，蛋白量含量≥50μg，優選500μg。

在另一優選例中，所述方法的檢測靈敏度達到10pmol或更低。

在另一優選例中，對于10pmol的樣品，唾液酸檢測信噪比大于3。

在另一優選例中，所述方法中，步驟(2)之后，步驟(3)之前還包括瞬離步驟。

在另一優選例中，所述方法中，步驟(4)之后，步驟(5)之前還包括振蕩混勻步驟。

在另一優選例中，所述方法中，步驟(4)之后，步驟(5)之前還包括離心步驟。

在另一優選例中，所述方法中，所述離心步驟為5000-20000rpm離心1-15分鐘，如13000r/min離心5分鐘。

在另一優選例中，步驟(2)中所述酸水解所用酸選自下組：乙酸、三氟乙酸、硫酸、鹽酸、甲酸、三氯乙酸、磷酸、硝酸。