[發明專利]一種大規模繼代培養天山雪蓮細胞的工藝

在審

• 申請號: 201710078816.X
• 申請日: 2017-02-14
• 公開（公告）號: CN106867958A
• 公開（公告）日: 2017-06-20
• 發明（設計）人: 張桂才;何樂雨;何俊雄;侯蒙蒙;劉曉月;劉永彬;張衛
• 申請（專利權）人: 天津艾賽博生物技術有限公司
• 主分類號: C12N5/04
• 分類號: C12N5/04;C12M1/04;C12M1/10
• 代理公司: 天津合志慧知識產權代理事務所(普通合伙)12219
• 代理人: 張勇

技術領域

本發明涉及植物細胞培養方法及生產植物細胞次級代謝產物的方法。

背景技術

天山雪蓮為菊科植物雪蓮(Saussureainvolucrata(Kar.etKir)Sch.-Bip.Linnaea)的干燥地上部分，是中國特有的藥用植物，其有效成分主要包括生物堿類化合物、黃酮類化合物、苯丙素類化合物、倍半萜內酯及其苷類化合物、多糖類化合物及揮發油類化合物，一般以總黃酮及總蛋白含量作為評價天山雪蓮質量的指標。因為野生資源日益匱乏，天山雪蓮已被國家列為二級瀕危植物，采集得到的天山雪蓮已經無法滿足日益增長的醫療保健用途需求。通過植物細胞工程技術對雪蓮進行細胞培養，找到了解決雪蓮短缺的良好途徑，但當前大規模培養天山雪蓮細胞時，一方面由于天山雪蓮細胞耐受剪切力較低造成難于攪拌均勻，并隨之帶來了需氧量不均勻等問題，另一方面大規模培養時得到的天山雪蓮細胞與天然的天山雪蓮在有效成分含量，尤其是“總黃酮和總蛋白含量”上還有差距。

中國專利ZL201210021722.6公開了一種帶有曝氣裝置的波浪回頭式生物反應器，通過改進的生物反應器結構可以解決天山雪蓮細胞耐受剪切力較低造成難于攪拌均勻的問題，但如何優化繼代培養條件，提高天山雪蓮細胞的有效成分含量，并提供一種穩定的能夠大規模培養天山雪蓮細胞并能夠使其有效成分含量保持在較高水平的的繼代工藝成為現有技術中亟待解決的問題。

發明內容

為解決前述技術問題，本發明提供了一種大規模繼代培養天山雪蓮細胞的工藝，通過優化工藝條件，不但能夠在大規模培養天山雪蓮細胞時提高細胞產量，而且能夠提高培養得到的天山雪蓮細胞中有效成分。

本發明提供了一種大規模繼代培養天山雪蓮細胞的工藝，其特征在于所述工藝包括以下步驟：

1)天山雪蓮細胞系篩選：采用天然雪蓮試管苗進行外植體誘導，獲得愈傷組織，對固體細胞進行Ser-137、uv-B誘變，低溫4℃處理，將MS培養基的含糖量提高至50-100g/L后作為篩選培養基，以篩選培養基反復進行篩選獲得細胞系，進行細胞系篩選時的培養條件為23-25℃，光周期為16h/8h，光照強度為1000-3000Lux，每兩周繼代一次；

2)搖瓶規模繼代培養：挑選生長狀態良好，顏色鮮亮，質地緊實的固體細胞放入含有培養液的搖瓶中，培養液為含有0.4～0.6mg/L 6-BA、0.8～1.2mg/L NAA的MS生長培養基，所述MS生長培養基的含糖量為20～40g/L，細胞接種量為30～50g/L，培養條件為23-25℃，光周期為16h/8h，光照強度為1000-3000Lux，搖床轉速為100-120rpm，每7-10天繼代一次；

3)搖瓶轉反應器繼代培養：將搖瓶中細胞轉接到反應器中進行繼代培養，每次繼代培養的培養周期為7-10天，反應器中加入培養液，所述培養液為含有0.4～0.6mg/L6-BA、0.8～1.2mg/LNAA的MS培養基，所述MS生長培養基的含糖量為20～40g/L，培養條件為23-25℃，光周期為16h/8h，光照強度為1000-3000Lux，通氣保持反應器中培養液的溶氧濃度在2-6mg/L。

所述的的一種大規模繼代培養天山雪蓮細胞的工藝，其特征在于步驟3)中，每次繼代培養細胞鮮重翻倍量為3-5倍，培養完成時細胞鮮重不低于150g/L。

所述的一種大規模繼代培養天山雪蓮細胞的工藝，其特征在于步驟3)中，反應液中培養液的溶氧濃度保持在2～4mg/L。

所述的一種大規模繼代培養天山雪蓮細胞的工藝，其特征在于所述反應器為帶有曝氣裝置的波浪回頭式生物反應器。所述的帶有曝氣裝置的波浪回頭式生物反應器如中國專利ZL201210021722.6中所述。

所述的一種大規模繼代培養天山雪蓮細胞的工藝，其特征在于步驟3)搖瓶轉反應器培養包括以下步驟

3.1)搖瓶轉20L反應器繼代培養，將搖瓶細胞無菌接入20L反應器中，接種量為30～50g/L，保持反應器振頻為5-15rpm，通氣量為0.1-0.3m³/h，完成繼代的細胞鮮重達到150g/L