[發(fā)明專利]一種大規(guī)模繼代培養(yǎng)天山雪蓮細(xì)胞的工藝

在審

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201710078816.X
• 申請(qǐng)日: 2017-02-14
• 公開（公告）號(hào): CN106867958A
• 公開（公告）日: 2017-06-20
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 張桂才;何樂雨;何俊雄;侯蒙蒙;劉曉月;劉永彬;張衛(wèi)
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 天津艾賽博生物技術(shù)有限公司
• 主分類號(hào): C12N5/04
• 分類號(hào): C12N5/04;C12M1/04;C12M1/10
• 代理公司: 天津合志慧知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(普通合伙)12219
• 代理人: 張勇

1.一種大規(guī)模繼代培養(yǎng)天山雪蓮細(xì)胞的工藝，其特征在于所述工藝包括以下步驟：

1)天山雪蓮細(xì)胞系篩選：采用天然雪蓮試管苗進(jìn)行外植體誘導(dǎo)，獲得愈傷組織，對(duì)固體細(xì)胞進(jìn)行Ser-137、uv-B誘變，低溫4℃處理，將MS培養(yǎng)基的含糖量提高至50-100g/L后作為篩選培養(yǎng)基，以篩選培養(yǎng)基反復(fù)進(jìn)行篩選獲得細(xì)胞系，進(jìn)行細(xì)胞系篩選時(shí)的培養(yǎng)條件為23-25℃，光周期為16h/8h，光照強(qiáng)度為1000-3000Lux，每?jī)芍芾^代一次；

2)搖瓶規(guī)模繼代培養(yǎng)：挑選生長(zhǎng)狀態(tài)良好，顏色鮮亮，質(zhì)地緊實(shí)的固體細(xì)胞放入含有培養(yǎng)液的搖瓶中，培養(yǎng)液為含有0.4～0.6mg/L 6-BA、0.8～1.2mg/L NAA的MS生長(zhǎng)培養(yǎng)基，所述MS生長(zhǎng)培養(yǎng)基的含糖量為20～40g/L，細(xì)胞接種量為30～50g/L，培養(yǎng)條件為23-25℃，光周期為16h/8h，光照強(qiáng)度為1000-3000Lux，搖床轉(zhuǎn)速為100-120rpm，每7-10天繼代一次；

3)搖瓶轉(zhuǎn)反應(yīng)器繼代培養(yǎng)：將搖瓶中細(xì)胞轉(zhuǎn)接到反應(yīng)器中進(jìn)行繼代培養(yǎng)，每次繼代培養(yǎng)的培養(yǎng)周期為7-10天，反應(yīng)器中加入培養(yǎng)液，所述培養(yǎng)液為含有0.4～0.6mg/L 6-BA、0.8～1.2mg/L NAA的MS培養(yǎng)基，所述MS生長(zhǎng)培養(yǎng)基的含糖量為20～40g/L，培養(yǎng)條件為23-25℃，光周期為16h/8h，光照強(qiáng)度為1000-3000Lux，通氣保持反應(yīng)器中培養(yǎng)液的溶氧濃度在2-6mg/L。

2.如權(quán)利要求1所述的一種大規(guī)模繼代培養(yǎng)天山雪蓮細(xì)胞的工藝，其特征在于步驟3)中，每次繼代培養(yǎng)細(xì)胞鮮重翻倍量為3-5倍，培養(yǎng)完成時(shí)細(xì)胞鮮重不低于150g/L。

3.如權(quán)利要求1～2任一所述的一種大規(guī)模繼代培養(yǎng)天山雪蓮細(xì)胞的工藝，其特征在于步驟3)中，反應(yīng)液中培養(yǎng)液的溶氧濃度保持在2～4mg/L。

4.如權(quán)利要求1所述的一種大規(guī)模繼代培養(yǎng)天山雪蓮細(xì)胞的工藝，其特征在于所述反應(yīng)器為帶有曝氣裝置的波浪回頭式生物反應(yīng)器。

5.如權(quán)利要求4所述的一種大規(guī)模繼代培養(yǎng)天山雪蓮細(xì)胞的工藝，其特征在于步驟3)搖瓶轉(zhuǎn)反應(yīng)器培養(yǎng)包括以下步驟

3.1)搖瓶轉(zhuǎn)20L反應(yīng)器繼代培養(yǎng)，將搖瓶細(xì)胞無(wú)菌接入20L反應(yīng)器中，接種量為30～50g/L，保持反應(yīng)器振頻為5-15rpm，通氣量為0.1-0.3m³/h；

3.2)20L轉(zhuǎn)200L反應(yīng)器繼代培養(yǎng)，在20L反應(yīng)器繼代培養(yǎng)結(jié)束后，通過無(wú)菌連接的方式將20L反應(yīng)器中完成繼代的細(xì)胞種源轉(zhuǎn)接入200L反應(yīng)器中，保持反應(yīng)器振頻為10-20rpm，并將空氣和氧氣的混合氣體通入到反應(yīng)器中，通氣量為0.4-1.0m³/h，混合氣體的初始氧氣比例為零，隨著培養(yǎng)過程梯度增加氧氣比例，每次將氧氣占混合氣體的體積百分比含量提高5-10個(gè)百分點(diǎn)，將溶氧濃度控制在2mg～6mg/L；

3.3)200L轉(zhuǎn)1000L反應(yīng)器繼代培養(yǎng)：在200L的反應(yīng)器繼代培養(yǎng)結(jié)束后，通過無(wú)菌連接的方式將200L反應(yīng)器中完成繼代的細(xì)胞種源轉(zhuǎn)接到1000L反應(yīng)器中，培養(yǎng)第1-5天的反應(yīng)器振頻為10-15rpm，培養(yǎng)第6天以上的反應(yīng)器振頻為15-25rpm；并將空氣和氧氣的混合氣體通入到反應(yīng)器中，通氣量為1.5-4.0m³/h，混合氣體的初始氧氣比例為零，隨著培養(yǎng)過程梯度增加氧氣比例，每次將氧氣占混合氣體的體積百分比含量提高10-20個(gè)百分點(diǎn)，將溶氧濃度控制在2mg～6mg/L。

6.如權(quán)利要求5所述的一種大規(guī)模繼代培養(yǎng)天山雪蓮細(xì)胞的工藝，其特征在于步驟3)中，反應(yīng)液中培養(yǎng)液的溶氧濃度保持在2～4mg/L。