[發(fā)明專利]潛伏感染的鯉皰疹病毒3型DNA的提取方法、套式PCR檢測方法及其試劑盒

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 201710077286.7
• 申請日: 2017-02-14
• 公開（公告）號: CN106801049A
• 公開（公告）日: 2017-06-06
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 王慶;鄭樹城;李瑩瑩;曾偉偉;王英英;劉春;任燕;石存斌;吳杰興
• 申請（專利權(quán)）人: 中國水產(chǎn)科學(xué)研究院珠江水產(chǎn)研究所
• 主分類號: C12N15/10
• 分類號: C12N15/10;C12Q1/70;C12Q1/68;C12N15/11;C12R1/93
• 代理公司: 佛山幫專知識產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(普通合伙)44387
• 代理人: 胡麗琴

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于生物基因檢測領(lǐng)域，具體涉及潛伏感染的鯉皰疹病毒3型DNA的提取方法，該DNA的套式PCR檢測方法及其試劑盒。

背景技術(shù)

鯉皰疹病毒3型(Cyprinid herpesvirus 3,CyHV-3)，又稱為錦鯉皰疹病毒(Koi herpe-svirus,KHV)，鯉魚間質(zhì)性腎炎及鰓壞死病毒(Carp interstitial nephritis and gill necrosis virus,CNGV)，是引起鯉魚和錦鯉高度傳染性病毒病的病原。該病于1997年在德國首次報道，1998年該病病原在以色列、美國首次鑒定，之后陸續(xù)在全球多個國家報道。2002年，印度尼西亞和中國臺灣地區(qū)首次報道CyHV-3導(dǎo)致鯉魚和錦鯉大規(guī)模死亡的現(xiàn)象，是除了以色列以外亞洲KHVD暴發(fā)最早的國家和地區(qū)；2003年，日本也首次證實了KHVD暴發(fā)；到目前為止，包括亞洲、歐洲和北美洲等多個國家均發(fā)現(xiàn)該病毒。自從2002年我國大陸在進口的錦鯉中檢測到KHV以來，多個地區(qū)的鯉魚和錦鯉養(yǎng)殖場均有CyHV-3感染或KHVD暴發(fā)的報道，如2003年以來東北地區(qū)的鯉魚感染CyHV-3暴發(fā)疾病，死亡率達80～90％；2004年，海南某錦鯉養(yǎng)殖場患病錦鯉發(fā)現(xiàn)KHV感染；2013年，廣州一錦鯉養(yǎng)殖場KHVD暴發(fā)，死亡率高達100％等。錦鯉皰疹病毒病給我國及世界多個國家鯉魚及錦鯉養(yǎng)殖業(yè)造成了嚴重的經(jīng)濟損失，因而該疾病的防治成為亟需解決的重要問題。

2000年，Hedrick等將該病病原命名為KHV。2003年，Ronen等人根據(jù)病毒引起的疾病病理特征建議命名為鯉魚間質(zhì)性腎炎及鰓壞死病毒；2005年，基于解螺旋酶基因、內(nèi)衣殼三重蛋白基因、DNA聚合酶基因和主要衣殼蛋白基因序列分析KHV與CyHV-1、CyHV-2和鮰類皰疹病毒1(IcHV-1)的關(guān)系，顯示KHV與CyHV-1、CyHV-2關(guān)系非常接近，與IcHV-1關(guān)系較遠，因此建議將該病毒命名為鯉皰疹病毒3型(CyHV-3)。2009年，國際病毒分類委員會(International Committee on Taxonomy of Viruses,ICTV)正式采用CyHV-3命名，并將其列入皰疹病毒目(Herpesvirales)，異皰疹病毒科(Alloherpesviridae)，鯉皰疹病毒屬(Cyprinivirus)，與鯉皰疹病毒1型(Cyprinid herpesvirus 1,CyHV-1；又稱為鯉魚痘皰疹病毒)、鯉科皰疹病毒2型(Cyprinid herpesvirus 2,CyHV-2；又稱為金魚造血組織壞死病毒)和鰻魚皰疹病毒(Anguillidherpesvirus 1，AngHV-1)在分類上同屬。

皰疹病毒的特點之一是在初次感染后具有潛伏宿主的能力，即病毒在宿主內(nèi)存留遺傳物質(zhì)但不復(fù)制病毒顆粒，基因不表達或僅有少數(shù)潛伏相關(guān)基因表達；在一定的應(yīng)激條件下，如改變溫度，潛伏的病毒可被誘導(dǎo)復(fù)制并釋放病毒粒子，導(dǎo)致宿主出現(xiàn)疾病的臨床癥狀；潛伏感染分為建立、維持及復(fù)活三個階段。

研究證實，鯉皰疹病毒3型也存在潛伏感染，主要潛伏位點是白細胞，其中IgM+白細胞潛伏數(shù)量比IgM-白細胞多；另外，腦、腎臟、脾臟、肝臟、胰臟、鰓、心臟、腸道和眼睛等器官也可能是潛伏位點。Imajoh等研究發(fā)現(xiàn)CyHV-3可能以環(huán)狀DNA的形式潛伏于魚的體內(nèi)，這種環(huán)狀的基因組潛伏形式在其他病毒也有報道。另外，具有潛伏感染特性的DNA病毒在感染后可重新被激活，正是這種再激活的特點使其在治療上令人費解。目前，潛伏感染再激活機制在許多皰疹病毒包括CyHV-3還處于探究之中。雖然有不少實驗發(fā)現(xiàn)CyHV-3潛伏感染再激活與溫度存在關(guān)系，將CyHV-3生長非適宜溫度轉(zhuǎn)移到適宜溫度，可誘導(dǎo)病毒復(fù)制及釋放傳染性病毒顆粒；池塘排水或?qū)Ⅳ~轉(zhuǎn)移到另一個池塘所造成的壓力也可能會誘導(dǎo)病毒脫落。但這些與潛伏感染再激活相關(guān)因素的分子機理仍沒有十分清楚的認識，還有待更深入的研究。