[發(fā)明專利]潛伏感染的鯉皰疹病毒3型DNA的提取方法、套式PCR檢測(cè)方法及其試劑盒

在審

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201710077286.7
• 申請(qǐng)日: 2017-02-14
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN106801049A
• 公開(kāi)（公告）日: 2017-06-06
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 王慶;鄭樹(shù)城;李瑩瑩;曾偉偉;王英英;劉春;任燕;石存斌;吳杰興
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院珠江水產(chǎn)研究所
• 主分類號(hào): C12N15/10
• 分類號(hào): C12N15/10;C12Q1/70;C12Q1/68;C12N15/11;C12R1/93
• 代理公司: 佛山幫專知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(普通合伙)44387
• 代理人: 胡麗琴

1.一種潛伏感染的鯉皰疹病毒3型DNA的提取方法，具體步驟如下：

1)細(xì)胞分離：從待檢敏感宿主的尾靜脈采血，將血液與等體積的培養(yǎng)基混合后，加入淋巴細(xì)胞分離液后，離心分離得到淋巴細(xì)胞層；

2)將淋巴細(xì)胞層再次與培養(yǎng)基進(jìn)行混合后，再次離心分離，收集底部的淋巴細(xì)胞；

3)取步驟2)所得淋巴細(xì)胞，洗滌后用PBS重懸并計(jì)數(shù)；

4)DNA提取：步驟3)收集的淋巴細(xì)胞數(shù)達(dá)到10⁶以上后，按照DNA提取試劑盒說(shuō)明書(shū)，對(duì)淋巴細(xì)胞進(jìn)行DNA的提取。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的提取方法，其中，所述待檢敏感宿主為無(wú)臨床癥狀的鯉魚(yú)或錦鯉。

3.一種潛伏感染的鯉皰疹病毒3型DNA的套式PCR檢測(cè)方法，包括以下步驟：

(1)以待測(cè)樣品外周血液淋巴細(xì)胞的DNA為靶標(biāo)基因，采用如下引物組，

第一輪PCR引物組：

LanTk-F其核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示；

LanTK-R其核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示；

第二輪PCR引物組：

Lan TK-nested-F其核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示；

LanTK-nested-R其核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示；

(2)配制第一輪PCR反應(yīng)體系，進(jìn)行PCR反應(yīng)第一輪反應(yīng)擴(kuò)增得到第一輪擴(kuò)增產(chǎn)物；

(3)配制第二輪PCR反應(yīng)體系，進(jìn)行PCR反應(yīng)第二輪反應(yīng)擴(kuò)增得到第二輪擴(kuò)增產(chǎn)物；

(4)結(jié)果分析：將兩輪擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，用凝膠成像系統(tǒng)觀察并拍照得到兩輪擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度后進(jìn)行判斷：a)第一輪擴(kuò)增產(chǎn)物為412bp且第二輪擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)347bp；或者b)第一輪擴(kuò)增產(chǎn)物未見(jiàn)條帶，但第二輪擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)347bp；說(shuō)明待測(cè)樣品外周血液淋巴細(xì)胞中含有潛伏感染的鯉皰疹病毒3型DNA。

4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的套式PCR檢測(cè)方法，其中，所述步驟(2)中第一輪PCR反應(yīng)體系為：DNA模板5μl，10×buffer 5μl，MgCl₂濃度1.5mmol/L，第一輪PCR引物濃度0.2μmol/L，dNTP濃度0.4mmol/L，Taq酶2.5U，ddH₂O補(bǔ)齊至50μl。

5.根據(jù)權(quán)利要求3所述的套式PCR檢測(cè)方法，其中，所述步驟(3)中第二輪PCR反應(yīng)體系為：第一輪擴(kuò)增產(chǎn)物2μl，10×buffer 5μl，MgCl₂濃度1.5mmol/L，第二輪PCR引物濃度0.2μmol/L，dNTP濃度0.4mmol/L，Taq酶2.5U，ddH₂O補(bǔ)齊至50μl。

6.根據(jù)權(quán)利要求3所述的套式PCR檢測(cè)方法，其中，所述步驟(2)中第一輪PCR反應(yīng)和步驟(3)中第二輪PCR反應(yīng)的反應(yīng)條件均為：95℃5min；94℃30s，55℃30s，72℃30s，反應(yīng)35次循環(huán)；72℃10min。

7.一種檢測(cè)潛伏感染的鯉皰疹病毒3型的套式PCR檢測(cè)引物組，所述引物組包括第一輪PCR引物組和第二輪PCR引物組，其核苷酸序列分別如下所示：

第一輪PCR引物組：

LanTk-F其核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示；

LanTK-R其核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示；

第二輪PCR引物組：

LanTK-nested-F其核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示；

LanTK-nested-R其核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示。

8.一種含有權(quán)利要求7所述的引物組的潛伏感染的鯉皰疹病毒3型DNA的套式PCR檢測(cè)試劑盒。

9.一種潛伏感染的鯉皰疹病毒3型DNA的套式PCR檢測(cè)試劑盒，其包含含有權(quán)利要求7所述的引物組的引物液、Tap DNA聚合酶、PCR buffer和dNTP混合物。

10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的套式PCR檢測(cè)試劑盒，還含有陽(yáng)性對(duì)照液：CyHV-3基因組DNA；陰性對(duì)照液：健康鯉魚(yú)基因組DNA。