[發(fā)明專利]室溫下快速識(shí)別柑橘病害生防菌株的解旋酶依賴性擴(kuò)增反應(yīng)裝置

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201710077054.1
• 申請(qǐng)日: 2017-02-14
• 公開（公告）號(hào): CN106635746B
• 公開（公告）日: 2019-11-19
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 劉冰;朱軍民;吳思?jí)?/a>;蔣軍喜
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 江西農(nóng)業(yè)大學(xué)
• 主分類號(hào): C12M1/00
• 分類號(hào): C12M1/00
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

1.室溫下快速識(shí)別柑橘病害生防工程菌株ML27的裝置，由載玻片(1)、菌液腔(2)、儲(chǔ)液管(3)、顯示玻片(4)、牽拉活塞(5)、反應(yīng)管(6)、阻液片(14)構(gòu)成，其特征在于：所述的載玻片(1)是室溫下快速識(shí)別柑橘病害生防工程菌株ML27的裝置的骨架，玻璃質(zhì)，長(zhǎng)方體形，長(zhǎng)度為10-15厘米，寬度為3-5厘米，厚度為1-5毫米，制作時(shí)先用模具采用槽沉成形法制成上下兩部分，然后再采用集中的高溫火焰對(duì)上下兩部分邊緣局部加熱，依靠表面張力的作用使玻璃邊緣在軟化時(shí)變得圓滑，同時(shí)將兩部分融合在一起，形成內(nèi)部具管道的整體結(jié)構(gòu)；所述的菌液腔(2)是盛放柑橘病害生防工程菌株ML27的空間，梭形囊狀，長(zhǎng)度為0.5-1厘米，中央最粗橫截面橢圓形，橢圓的長(zhǎng)向直徑為0.5-0.8厘米，橢圓的短向直徑為0.1-0.2厘米；菌液腔(2)在載玻片(1)上的開口稱為菌液腔口(7)，菌液腔口(7)是將柑橘病害生防工程菌株ML27液體注入到菌液腔(2)中的入口，圓形，直徑為1-2毫米；菌液腔(2)另一端連通反應(yīng)管(6)，整個(gè)菌液腔(2)斜向位于載玻片(1)中，菌液腔(2)中軸與水平面呈20°-30°夾角；所述的儲(chǔ)液管(3)是儲(chǔ)存將柑橘病害生防工程菌株ML27細(xì)胞破裂和細(xì)胞中特異質(zhì)粒DNA常溫PCR以及染色反應(yīng)產(chǎn)物所需要的試劑的部件，共9個(gè)，依次設(shè)置在反應(yīng)管壁(25)的兩側(cè)，從菌液腔(2)向顯示玻片(4)方向的儲(chǔ)液管(3)管內(nèi)依次裝有10pmol引物1、10pmol引物2、100ngUvrD解旋酶、100ng DNA依賴性DNA聚合酶、400ng MutL蛋白、0.1-100mM的核苷三磷酸NTP10μl、1-10mM的脫氧核苷三磷酸dNTP10μl、1.2-12.5mM的二價(jià)鎂離子10μl和10μl核酸染料SYBR Green I；儲(chǔ)液管(3)的試劑與菌液接觸后能夠發(fā)生HDA解旋酶依賴性擴(kuò)增反應(yīng)，HDA反應(yīng)是一種通過使用解旋酶制備物解開雙鏈核酸以生成擴(kuò)增模板來擴(kuò)增核酸的常溫PCR反應(yīng)；每個(gè)儲(chǔ)液管(3)基部圓柱狀，直徑為0.5-3毫米，開口于載玻片(1)的側(cè)壁上，該開口稱為儲(chǔ)液管口(11)；每個(gè)儲(chǔ)液管(3)端部圓臺(tái)形，圓臺(tái)形頂部開口為儲(chǔ)液管孔(17)，儲(chǔ)液管(3)包括儲(chǔ)液管口(11)、儲(chǔ)液封堵(12)、儲(chǔ)液管孔封膜(16)、儲(chǔ)液管孔(17)、儲(chǔ)液管壁(18)和儲(chǔ)液管腔(19)；儲(chǔ)液管口(11)是儲(chǔ)液管(3)在載玻片(1)的側(cè)壁上的開口；儲(chǔ)液封堵(12)油質(zhì)，在反應(yīng)液置入儲(chǔ)液管(3)后被注入儲(chǔ)液管(3)，用于封堵儲(chǔ)液管(3)中的各種反應(yīng)液，并且在牽拉活塞(5)抽吸時(shí)，能夠像圓珠筆芯內(nèi)的封堵一樣，隨著反應(yīng)液的移動(dòng)而移動(dòng)，使得反應(yīng)液由于與外界隔絕而完全處于最初的無菌狀態(tài)，以免發(fā)生變質(zhì)反應(yīng)；操作時(shí)，首先在儲(chǔ)液管孔(17)外用蠟制成一個(gè)厚度為0.01-0.05毫米的薄膜，即儲(chǔ)液管孔封膜(16)，封堵住儲(chǔ)液管孔(17)，然后注入各自的試劑，注好后，接著注入油質(zhì)的儲(chǔ)液封堵(12)，即可使反應(yīng)所需的試劑被儲(chǔ)存于不同的儲(chǔ)液管(3)中；儲(chǔ)液管孔封膜(16)蠟質(zhì)，圓片狀，直徑為0.1-1毫米，厚度為0.01-0.05毫米；儲(chǔ)液管孔(17)直徑為0.1-1毫米，開口于反應(yīng)管壁(25)處；儲(chǔ)液管腔(19)是儲(chǔ)液管(3)基部和端部?jī)?nèi)的空腔，基部圓柱狀，直徑為0.5-3毫米，端部圓臺(tái)形，直徑為0.1-1毫米；所述的顯示玻片(4)是柑橘病害生防工程菌株ML27細(xì)胞破裂和細(xì)胞中特異質(zhì)粒DNA序列常溫PCR反應(yīng)后，擴(kuò)增的DNA與染色反應(yīng)產(chǎn)物所需要的試劑發(fā)生反應(yīng)，從進(jìn)液孔(13)由于表面張力造成液體在顯液腔(21)迅速擴(kuò)散，使得顏色顆粒彌散分布在顯液腔(21)內(nèi)，從而呈現(xiàn)出藍(lán)色的結(jié)構(gòu)，包括進(jìn)液孔(13)、釋壓孔(15)、顯液腔(21)、顯示基片(22)、顯示頂片(24)；顯示基片(22)是顯示玻片(4)下方的蓋玻片，長(zhǎng)度為0.5-2厘米，寬度為0.5-1.5厘米，厚度為0.01-0.05毫米，一側(cè)向上凸起，凸起的長(zhǎng)度為0.5-1.5厘米，寬度為0.01-0.05厘米，厚度為0.01-0.05毫米，在反應(yīng)管(6)上方有兩個(gè)孔，接近儲(chǔ)液管(3)一側(cè)的孔為進(jìn)液孔(13)，接近牽拉支板(10)一側(cè)的孔為釋壓孔(15)；進(jìn)液孔(13)為圓孔，直徑為0.05-0.1厘米，高度為0.01-0.05毫米，是反應(yīng)后液體進(jìn)入顯液腔(21)的通道；釋壓孔(15)為圓孔，直徑為0.05-0.1厘米，高度為0.01-0.05毫米，是為反應(yīng)后液體進(jìn)入顯液腔(21)緩解空氣阻力的通道，反應(yīng)后液體在顯液腔(21)中由于表面張力擴(kuò)散的過程中，逐漸占據(jù)顯液腔(21)的空間，迫使里面原來的氣體被壓擠，從釋壓孔(15)進(jìn)入反應(yīng)管(6)，并從牽拉索(9)與牽拉支板(10)中央圓孔之間的縫隙排出；顯示頂片(24)是顯示玻片(4)上方的蓋玻片，長(zhǎng)度為0.5-2厘米，寬度為0.5-1.5厘米，厚度為0.01-0.05毫米，與顯示基片(22)一側(cè)向上凸起相對(duì)應(yīng)的另一側(cè)也有一個(gè)凸起，顯示頂片(24)與顯示基片(22)上下之間和顯示頂片(24)與顯示基片(22)相對(duì)應(yīng)的凸起之間所共同形成的空間為顯液腔(21)；顯液腔(21)長(zhǎng)度為0.48-1.9厘米，寬度為0.5-1.5厘米，高度為0.01-0.05毫米，是將顏色反應(yīng)發(fā)生后將顏色顆粒分散從而使顏色能夠被肉眼看到的空間；牽拉活塞(5)設(shè)置在反應(yīng)管(6)中，在手動(dòng)牽拉牽拉索環(huán)(20)時(shí)，能夠?qū)坷钊^(8)牽引拉動(dòng)，使其在反應(yīng)管(6)發(fā)生位移，是將菌液腔(2)中的菌液和儲(chǔ)液管(3)中的反應(yīng)液抽吸到反應(yīng)管腔(23)中形成混合液體，使混合液體發(fā)生反應(yīng)的動(dòng)力部件，包括牽拉活塞頭(8)、牽拉索(9)、牽拉支板(10)和牽拉索環(huán)(20)；牽拉活塞頭(8)橡膠質(zhì)，圓柱形，直徑為0.5-3毫米，長(zhǎng)度為0.5-1毫米，牽拉活塞頭(8)底面中央固著有牽拉索(9)，牽拉活塞頭(8)在反應(yīng)管(6)發(fā)生位移時(shí)，能夠改變反應(yīng)管(6)內(nèi)的壓力，產(chǎn)生抽吸力量，將液體吸入反應(yīng)管腔(23)中，同時(shí)，牽拉活塞頭(8)在移動(dòng)過程中，還可以將儲(chǔ)液管孔封膜(16)從儲(chǔ)液管孔(17)處刮掉，以便儲(chǔ)液管腔(19)中的反應(yīng)液被抽吸出來；牽拉索(9)由市售的釣魚線制成，橫截面圓形，直徑為0.1-0.5毫米，與牽拉支板(10)中央的圓孔和阻液片(14)中央的圓孔之間有寬度為0.4-0.5毫米的縫隙，一端固定在牽拉活塞頭(8)底面中央，另一端形成牽拉索環(huán)(20)，供使用者伸進(jìn)手指牽拉牽拉活塞(5)，使其在反應(yīng)管(6)移動(dòng)；牽拉索環(huán)(20)環(huán)形，環(huán)形直徑為3-5厘米；牽拉支板(10)圓片狀，直徑為1-5毫米，固定在反應(yīng)管(6)末端，中央有一個(gè)直徑為0.5-1毫米的圓孔，供牽拉索(9)在其中穿行，同時(shí)還是牽拉索(9)出入反應(yīng)管(6)的支點(diǎn)；所述的反應(yīng)管(6)是將柑橘病害生防工程菌株ML27細(xì)胞破裂，將細(xì)胞中特異質(zhì)粒DNA常溫PCR，并使反應(yīng)產(chǎn)物由于表面張力擴(kuò)散而被吸到顯示玻片(4)通過染色顯示出來的部件，內(nèi)部設(shè)置有牽拉活塞(5)和阻液片(14)，兩側(cè)壁上開口有儲(chǔ)液管孔(17)，上壁通過進(jìn)液孔(13)和釋壓孔(15)與顯液腔(21)相通連，圓柱形，長(zhǎng)度為5-10厘米，橫截面圓形，圓形直徑為0.5-3毫米，包括反應(yīng)管腔(23)和反應(yīng)管壁(25)；反應(yīng)管腔(23)是將柑橘病害生防工程菌株ML27細(xì)胞破裂和將菌株ML27細(xì)胞中特異質(zhì)粒DNA常溫PCR的空間，圓柱形，長(zhǎng)度為5-10厘米，橫截面圓形，圓形直徑為1-3毫米，與菌液腔(2)、儲(chǔ)液管腔(19)、和顯液腔(21)相連通，最外端被牽拉支板(10)封堵；反應(yīng)管壁(25)是圍成反應(yīng)管腔23的結(jié)構(gòu)，反應(yīng)管壁(25)上有儲(chǔ)液管口(11)、進(jìn)液孔(13)和釋壓孔(15)，在進(jìn)液孔(13)和釋壓孔(15)之間還設(shè)置有前后兩個(gè)阻液片(14)；所述的阻液片(14)圓片狀，直徑為0.5-3毫米，中間有一個(gè)直徑為0.5-1毫米的圓孔，供牽拉索(9)在其中穿行，周緣固定在反應(yīng)管壁(25)上。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的室溫下快速識(shí)別柑橘病害生防工程菌株ML27的裝置，其特征在于：所述的柑橘病害生防工程菌株ML27特異質(zhì)粒pML27是長(zhǎng)度為2628bp的核酸序列，其堿基組成如Seq ID No:1所示；采用HAD反應(yīng)擴(kuò)增質(zhì)粒pML27所用引物為引物1和引物2，引物1是長(zhǎng)度為23bp的核酸序列，其堿基組成如Seq ID No:2所示；引物2是長(zhǎng)度為22bp的核酸序列，其堿基組成如Seq ID No:3所示。