[發明專利]室溫下快速識別柑橘病害生防菌株的解旋酶依賴性擴增反應裝置

有效

• 申請號: 201710077054.1
• 申請日: 2017-02-14
• 公開（公告）號: CN106635746B
• 公開（公告）日: 2019-11-19
• 發明（設計）人: 劉冰;朱軍民;吳思夢;蔣軍喜
• 申請（專利權）人: 江西農業大學
• 主分類號: C12M1/00
• 分類號: C12M1/00
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

室溫下快速識別柑橘病害生防菌株的解旋酶依賴性擴增反應裝置，屬于植物病理學技術領域，由載玻片(1)、菌液腔(2)、儲液管(3)、顯示玻片(4)、牽拉活塞(5)、反應管(6)、阻液片(14)構成，其特征在于：所述的反應管(6)內部設置有牽拉活塞(5)和阻液片(14)，兩側壁上開口有儲液管孔(17)，上壁通過進液孔(13)和釋壓孔(15)與顯液腔(21)相通連；反應管腔(23)與菌液腔(2)、儲液管腔(19)、和顯液腔(21)相連通，最外端被牽拉支板(10)封堵；反應管壁(25)上有儲液管口(11)、進液孔(13)和釋壓孔(15)。該裝置制作簡單，可操作性強，成本低廉，效果明顯。

技術領域

本發明涉及一種室溫下快速識別柑橘病害生防菌株的解旋酶依賴性擴增反應裝置，屬于植物病理學技術領域。

背景技術

聚合酶鏈式反應PCR廣泛應用于研究、法醫學和農業，PCR通常利用與靶序列的5'和3'邊界雜交的兩種寡核苷酸引物和通過聚合脫氧核糖核苷酸三磷酸dNTP延伸退火引物以生成雙鏈產物的DNA依賴性DNA聚合酶。通過提高和降低反應混合物的溫度稱為熱循環，DNA產物的兩條鏈被分開，并且可以充當下一輪退火和延伸的模板，同時重復該過程。目前，PCR技術廣泛用于菌株的鑒定和檢測，具有方便快捷的特點。生防菌株在進行田間施用時，定殖數量是其成功發揮其生防效果的關鍵。而在實際生產中，菌株的定殖受多種環境因素的影響，這往往使我們很難確定其定殖狀況，從而可能導致防效不佳的后果。如果能在田間快速方便地對生防菌進行識別的話，那就能確定所用生防菌的有效性，從而決定是否施用及下一次的施用時間，可以一定程度上降低生防菌的使用成本。因此，生防菌的田間施用需要常溫的PCR反應。目前，最常用最有效的常溫PCR反應為HAD。HAD指解旋酶依賴性擴增，是一種通過使用解旋酶制備物解開雙鏈核酸以生成擴增模板來擴增核酸的體外方法。其中，解旋酶指能夠解開雙鏈核酸的酶，它可沿著DNA以5'-3'方向或以相反的3'-5'方向移位。通過實驗，我們發現柑橘病害生防菌株ML27對柑橘炭疽病菌的抑菌率為72.15％，對柑橘潰瘍病菌的抑菌圈為2.05厘米，其抑菌的機理主要是對真菌的細胞壁產生影響，對細菌的菌體具有溶解作用。可見，該菌株有較好的生防潛力，我們的溫室試驗也證明確實如此。那么，ML27在田間的防治效果和施用情況就成為我們研究的重點。鑒于田間環境的復雜性，研究常溫PCR以便快速檢測生防菌株成為繼續解決的一大難題。而我們試驗中發現，在柑橘病害生防菌株ML27中，有一種特異的質粒pML27，只存在于菌株ML27中，這為常溫PCR裝置的設計提供了條件。因此，如何研究出一種解旋酶依賴性擴增反應裝置，設計出特定菌株所需的引物，放入特定的反應液，即可在室溫下檢測柑橘病害生防菌株的定殖量，是保證這些菌株在田間有效使用的重要因素。所以利用HAD技術，設計出特定柑橘病害生防菌株ML27的引物，發明一種室溫下快速識別柑橘病害生防菌株的解旋酶依賴性擴增反應裝置是必要的。

發明內容

為了克服的難題，本發明提供了室溫下快速識別柑橘病害生防菌株的解旋酶依賴性擴增反應裝置，該室溫下快速識別柑橘病害生防菌株的解旋酶依賴性擴增反應裝置利用HAD(解旋酶依賴性擴增)技術，設計出柑橘病害生防菌株比如ML27特異質粒pML27的引物，擴增出特異質粒pML27，在1小時內將靶序列擴增至10⁹-10¹⁰倍，然后采用核酸染料SYBRGreen I對擴增后的特異質粒pML27染色，當反應液中加入核酸染料SYBR Green I后(SYBRGreen I:一種核酸染料)，在紫外光或日光下通過肉眼可進行判斷，如果含有擴增產物，反應混合物變綠；反之，則保持SYBR Green I的橙色不變,從而達到室溫下快速識別該柑橘病害生防菌株的目的。

本發明解決其技術問題所采用的技術方案是：