[發明專利]壁蛻膜組織凍存、復蘇及分離培養間充質干細胞的方法

在審

• 申請號: 201710076798.1
• 申請日: 2017-02-13
• 公開（公告）號: CN107022521A
• 公開（公告）日: 2017-08-08
• 發明（設計）人: 王進輝;李東升;許峻榮;楊陽;陳智聰;鐘翠婷;于莉
• 申請（專利權）人: 廣東唯泰生物科技有限公司
• 主分類號: C12N5/0735
• 分類號: C12N5/0735;A01N1/02
• 代理公司: 廣州新諾專利商標事務所有限公司44100
• 代理人: 許英偉

技術領域

本發明屬于細胞生物學領域，具體涉及一種壁蛻膜組織凍存、復蘇及分離培養間充質干細胞的方法。

背景技術

隨著再生醫學的興起，細胞療法正得到不斷發展，間充質干細胞因為來源廣泛，分離培養容易，增殖和多向分化能力強，已成為細胞治療領域的研究熱點。

間充質干細胞(Mesenchymal Stem Cells，MSCs)起源于中胚層，是成體干細胞的一種。因具有來源廣泛、獲取容易、擴增能力強、免疫原性低、非致瘤、能歸巢、無醫學倫理學爭議等優點而成為再生醫學、細胞療法中的主要選擇細胞。已發現這種細胞能分化為中胚層的多種成熟組織細胞，如骨、脂肪、肌肉、軟骨和血管內皮等，近年來發現了間充質干細胞的可塑性，即能跨胚層分化

神經細胞、肝細胞、腎小管上皮細胞、肺細胞、胰島β細胞等非中胚層細胞。間充質干細胞因具有多向分化和自身更新、低免疫原性及免疫調節抑制作用，在組織工程、器官移植及治療免疫介導疾病的領域中具有十分廣闊的應用前景。

間充質干細胞的來源有很多，包括胎盤、臍帶、臍帶血、骨髓、脂肪、牙髓、皮膚等。胎盤來源間充質干細胞與骨髓間充質干細胞相比，具有來源充足、免疫原性低、病毒污染率較低，且無社會倫理爭議等方面的優點，使其具有更好的臨床應用前景。從胎盤中的多種組織均可提取到間充質干細胞，如羊膜、絨毛膜、蛻膜、胎盤小葉和胎盤等。

壁蛻膜作為母體組成部分之一，從中分離得到的蛻膜間充質干細胞(Decidua-derived Mesenchymal Stem Cells，DMSCs)可以用于母親自身細胞的移植或凍存，具有針對性。蛻膜間充質干細胞在表型、增殖及細胞因子表達等方面與其他來源的間充質干細胞存在差別，具有獨特的性質，如低免疫原性等，近年來已經引起眾多科學家關注，蛻膜間充質干細胞子宮內膜重建、盆腔臟器脫垂、膀胱組織修復等組織修復具有廣闊的應用前景。

但從胎盤壁蛻膜組織分離干細胞的方法和技術目前還不是完全成熟，較難得到純凈的母親源間充質干細胞，而且每一份胎盤壁蛻膜組織的處理、分離和培養都需要消耗一定的人力、物力和時間成本。因此將壁蛻膜組織凍存并且在有需要的時候復蘇進行干細胞分離的做法相對更符合成本效益。

發明內容

本發明克服了現有技術中的缺點，提供了一種壁蛻膜組織凍存、復蘇及分離培養間充質干細胞的方法，可應用于母親來源的壁蛻膜組織的保存，壁蛻膜組織可以在液氮深低溫環境長期保存，避免復蘇過程中細胞存活率流失。

為了解決上述技術問題，本發明是通過以下技術方案實現的：

壁蛻膜組織凍存、復蘇及分離培養間充質干細胞的方法，包括以下步驟：

(1)胎盤組織的預處理：在無菌環境下采集胎盤及母血，存放于胎盤組織采集套裝內，貼好標簽，維持溫度在4-22℃，送達實驗室進行處理；取出胎盤后，75％酒精噴灑消毒胎盤組織的外表面2min后，迅速用組織保護液清洗沖洗組織外表面的殘留血液和血凝塊，并對胎盤和母血樣本進行檢測，檢測的項目包括谷丙轉氨酶(ALT)、谷草轉氨酶(AST)；皰疹病毒(EB)；巨細胞病毒(CMV)；艾滋病毒(HIV)；梅毒螺旋體(TP)；乙肝病毒(HBV)；丙肝病毒(HCV)；嗜T細胞病毒(HTLV)、細菌和真菌等；

(2)胎盤壁蛻膜組織的分離及處理：將分離獲得的胎盤用生理鹽水清洗后，剝離壁蛻膜，并將分離下來的壁蛻膜剪成2mm³小塊置于離心管中；

(3)胎盤壁蛻膜組織的凍存：配制壁蛻膜組織凍存液，4℃條件下低溫冷藏，然后按每管1mL分裝到凍存管中，降溫，最后于-196℃過夜保存，待微生物檢測為陰性后轉入液氮中長期保存；

(4)胎盤壁蛻膜組織的復蘇：將步驟(3)冷凍的胎盤壁蛻膜組織從液氮中取出，37℃條件快速解凍，利用間充質干細胞培養基清洗壁蛻膜組織，過濾去除廢液，以使凍存的壁蛻膜組織復蘇；

(5)從胎盤壁蛻膜組織中分離間充質干細胞：使用Accutase^TM細胞消化液對壁蛻膜組織進行消化，將消化后的壁蛻膜進行過濾，洗滌后得間充質干細胞，將間充質干細胞在臨床級無血清培養基中培養；此后每3天換液一次，至細胞融合度達80％以上時，對間充質干細胞進行傳代，使用Accutase^TM細胞消化液消化后，用臨床級無血清培養傳代培養；