[發明專利]壁蛻膜組織凍存、復蘇及分離培養間充質干細胞的方法

在審

• 申請號: 201710076798.1
• 申請日: 2017-02-13
• 公開（公告）號: CN107022521A
• 公開（公告）日: 2017-08-08
• 發明（設計）人: 王進輝;李東升;許峻榮;楊陽;陳智聰;鐘翠婷;于莉
• 申請（專利權）人: 廣東唯泰生物科技有限公司
• 主分類號: C12N5/0735
• 分類號: C12N5/0735;A01N1/02
• 代理公司: 廣州新諾專利商標事務所有限公司44100
• 代理人: 許英偉

1.壁蛻膜組織凍存、復蘇及分離培養間充質干細胞的方法，其特征在于，包括以下步驟：

(1)胎盤組織的預處理：在無菌環境下采集胎盤及母血，存放于胎盤組織采集套裝內，貼好標簽，維持溫度在4-22℃，送達實驗室進行處理；取出胎盤后，75％酒精噴灑消毒胎盤組織的外表面2min后，迅速用組織保護液清洗沖洗組織外表面的殘留血液和血凝塊，并對胎盤和母血樣本進行檢測，檢測的項目包括谷丙轉氨酶(ALT)、谷草轉氨酶(AST)；皰疹病毒(EB)；巨細胞病毒(CMV)；艾滋病毒(HIV)；梅毒螺旋體(TP)；乙肝病毒(HBV)；丙肝病毒(HCV)；嗜T細胞病毒(HTLV)、細菌和真菌等；

(2)胎盤壁蛻膜組織的分離及處理：將分離獲得的胎盤用生理鹽水清洗后，剝離壁蛻膜，并將分離下來的壁蛻膜剪成2mm³小塊置于離心管中；

(3)胎盤壁蛻膜組織的凍存：配制壁蛻膜組織凍存液，4℃條件下低溫冷藏，然后按每管1mL分裝到凍存管中，降溫，最后于-196℃過夜保存，待微生物檢測為陰性后轉入液氮中長期保存；

(4)胎盤壁蛻膜組織的復蘇：將步驟(3)冷凍的胎盤壁蛻膜組織從液氮中取出，37℃條件快速解凍，利用間充質干細胞培養基清洗壁蛻膜組織，過濾去除廢液，以使凍存的壁蛻膜組織復蘇；

(5)從胎盤壁蛻膜組織中分離間充質干細胞：使用Accutase^TM細胞消化液對壁蛻膜組織進行消化，將消化后的壁蛻膜進行過濾，洗滌后得間充質干細胞，將間充質干細胞在臨床級無血清培養基中培養；此后每3天換液一次，至細胞融合度達80％以上時，對間充質干細胞進行傳代，使用Accutase^TM細胞消化液消化后，用臨床級無血清培養傳代培養；

(6)壁蛻膜干細胞的傳代培養：當貼壁細胞融合率達到80％左右，可利用Accutase^TM細胞消化液將貼壁細胞脫離平皿底部，離心后移除上清液，并加入間充質干細胞培養基重新懸浮細胞，接種于T25細胞培養瓶進行傳代，并進行擴增培養；此后每3天換液一次直至融合率達到80％后，即得，必要時再進行傳代。

2.根據權利要求1所述壁蛻膜組織凍存、復蘇及分離培養間充質干細胞的方法，其特征在于，步驟(1)中所述的組織保護液，為DMEM/F12和1％的抗生素構成；抗生素為青霉素、鏈霉素或兩性霉素B。

3.根據權利要求1所述壁蛻膜組織凍存、復蘇及分離培養間充質干細胞的方法，其特征在于，步驟(2)中所述剝離壁蛻膜的步驟為手術器械剝離胎盤表面的羊膜，完整分離胎盤組織邊緣連接的絨毛膜組織及附著于表面的壁蛻膜組織，用組織保護液清洗血液和血凝塊，刮取壁蛻膜組織，清洗后收集于50ml離心管中。

4.根據權利要求1所述壁蛻膜組織凍存、復蘇及分離培養間充質干細胞的方法，其特征在于，步驟(3)中所述的降溫程序如下：先于4℃平衡30min，然后以1℃/min的速度降至-5℃，接著以21℃/min的速度降至-54℃，再以10℃/min的速度升溫至-21℃，然后以2℃/min的速度降至-40℃，接著以10℃/min的速度降至-80℃，之后置于液氮罐中，深度儲存。

5.根據權利要求1所述壁蛻膜組織凍存、復蘇及分離培養間充質干細胞的方法，其特征在于，步驟(3)中所述的組織凍存液含有海藻糖、DMSO、人血白蛋白和無血清完全培養基。

6.根據權利要求1所述壁蛻膜組織凍存、復蘇及分離培養間充質干細胞的方法，其特征在于，步驟(5)中所述的臨床級無血清培養基的成分為：基礎培養基DMEM/F12、20-50ng/mL血小板衍生生長因子(PDGF-BB)、10-20ng/mL堿性成纖維細胞生長因子(bFGF)、5-10ng/mL干細胞生長因子(SCF)、10-20ng/mL表皮細胞生長因子(EGF)、3-5mg/mL轉鐵蛋白、20-100ug/mL維生素C、1～5mmol/ml L-谷氨酰胺、5-30g/L人血白蛋白(HSA)、5-10μg/ml胰島素、30-40ng/ml纖粘連蛋白、1-2x10-6mol/L氫化可的松、100U/ml青霉素及100mg/ml鏈霉素。

7.根據權利要求1所述壁蛻膜組織凍存、復蘇及分離培養間充質干細胞的方法，其特征在于，步驟(5)中所述的Accutase^TM細胞消化液是一種包含有蛋白水解酶和膠原酶活性的一種細胞消化液。