[發明專利]一種洋金花藥材的鑒別方法

有效

• 申請號: 201710076392.3
• 申請日: 2017-02-13
• 公開（公告）號: CN106770037B
• 公開（公告）日: 2018-02-27
• 發明（設計）人: 李萍;趙小艾;屠禮凡;宋慧鵬;王紅
• 申請（專利權）人: 中國藥科大學
• 主分類號: G01N21/41
• 分類號: G01N21/41;G01N30/02
• 代理公司: 南京匯盛專利商標事務所(普通合伙)32238
• 代理人: 趙超

技術領域

本發明涉及中藥材的鑒別與質量控制方法，具體涉及基于共振波導光柵傳感器的洋金花藥材鑒別方法。

背景技術

洋金花，又名南洋金花、風茄花、白花曼陀羅，為茄科植物白花曼陀羅Datura metel L.的干燥花。性溫、味辛、有毒，歸心、肺、肝經。可用于咳嗽哮喘、風濕痹痛、脘腹冷痛和外科麻醉等。東莨菪堿和莨菪堿為其主要功效成分，對毒蕈堿型膽堿受體具有拮抗作用。洋金花主要分布于江蘇、安徽、四川、廣東、福建等地。其混淆品眾多，例如凌霄花、鬧羊花、百合花、泡桐花。它們的性狀特征相似，但功效卻相差甚遠。若不能加以區分，則無法保證用藥的安全性和有效性。

《中國藥典》中對洋金花的鑒別，采用了顯微鑒別和理化鑒別兩種方式。顯微鑒別對洋金花花粉粒、花萼非腺毛等性狀都有明確規定。該方法雖然簡單，但由于洋金花與其混淆品在很多方面性狀相似，顯微鑒別的準確性很大程度上依賴于操作者的經驗。理化鑒別是以硫酸阿托品和氫溴酸東莨菪堿為對照品，將供試品溶液和對照品溶液分別于同一硅膠G薄層板上展開，對比供試品和對照品在相應的位置上是否顯示相同顏色的斑點。此方法具有操作繁雜、通量小和效率低等缺點。

發明內容

本發明的目的是提供一種通量高、專屬性強的洋金花藥材鑒別方法，能夠有效區分洋金花及其7種易混偽品。

本發明的檢測原理是細胞膜受體接受刺激會引起細胞內部動態質量再分布，而光學傳感器能夠檢測由于細胞內質量再分布產生的折光率的變化，該變化與產生刺激的小分子的量成正比(圖1)。

本發明涉及一種洋金花藥材的鑒定方法，其中包括：基于共振波導光柵傳感器的二相表型藥理鑒別法、HPLC，包括如下五個步驟：

(1)藥材的提取、

(2)用共振波導光柵傳感器檢測藥材提取液刺激CHO-M₂細胞所產生的藥理表型、

(3)用共振波導光柵傳感器檢測乙酰膽堿和藥材提取液共同刺激CHO-M₂細胞所產生的整合藥理表型、

(4)整合第2、3步的藥理表型，并與洋金花藥材表型進行比對。

(5)基于共振波導光柵傳感器的二相表型藥理鑒別法與HPLC的聯合用于鑒定洋金花藥材質量

具體步驟如下：

(1)藥材的提取：精密稱定1g藥材粉末，置錐形瓶中，加入10mL濃度為2mol/L的鹽酸溶液，超聲處理(功率250W，頻率40kHz)30分鐘，放冷，濾過，濾渣和濾器用10mL上述鹽酸溶液分數次洗滌，合并濾液和洗液，用濃氨試液調節pH值至9，用三氯甲烷振搖提取4次，每次10mL，合并三氯甲烷，回收溶劑至干，殘渣用緩沖液溶解，轉移至5mL量瓶中，加緩沖液至刻度，搖勻，濾過，取續濾液用于測試。

(2)取20μL CHO-M₂細胞懸液接種在細胞測試板中，放入含有5％二氧化碳、溫度為37℃的培養箱中培養14小時。取出細胞測試板，移除培養基，用移液槍向每個孔中加入20μL Hank's平衡鹽溶液。將測試板放入Corning EpicBT系統進行信號平衡。1小時后，將基線歸零并啟動一個新的信號記錄程序。記錄2分鐘后，暫停程序，用排槍將10μL提取液加入每個微孔中，并繼續記錄1小時。如果加入藥材提取液后檢測信號超過100pm，則該表型記為1；若信號在-100到100之間，則該表型記為0；若信號小于-100，則該表型記為-1。藥材提取液在該階段所產生的動態質量再分布信號即為第一相表型。

(3)在上述記錄程序結束后，重新開始一個程序。信號記錄2分鐘后暫停程序，用排槍向每個孔中加入10μL濃度為16μM的乙酰膽堿Hank's平衡鹽溶液，然后繼續記錄程序1小時。如果加入乙酰膽堿溶液后信號超過100pm，則該表型記為1；若信號在-100到100之間，則該表型記為0；若信號小于-100，則該表型記為-1。該階段產生的動態質量再分布信號即為第二相表型。

(4)綜合步驟2和3的表型，如果滿足(1,0)則為洋金花，其中“1”為步驟2的表型，“0”為步驟3的表型。否則，即為偽品藥材。

(5)按照如下條件對洋金花進行HPLC分析，將成分的峰面積或含量與藥材活性值進行關聯。

流動相A:含有0.0025mol/L庚烷磺酸鈉的水溶液，用磷酸調至pH＝5；

流動相B：乙腈。

分離條件為(以B％表示)：

0-13min，16-16％；

13-20min，16-18％；

20-28min，18-18％；

28-30min，18-20％；