[發(fā)明專利]一種洋金花藥材的鑒別方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201710076392.3
• 申請日: 2017-02-13
• 公開（公告）號: CN106770037B
• 公開（公告）日: 2018-02-27
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 李萍;趙小艾;屠禮凡;宋慧鵬;王紅
• 申請（專利權(quán)）人: 中國藥科大學(xué)
• 主分類號: G01N21/41
• 分類號: G01N21/41;G01N30/02
• 代理公司: 南京匯盛專利商標(biāo)事務(wù)所(普通合伙)32238
• 代理人: 趙超

1.一種洋金花藥材的鑒別方法，其特征是：包括：

基于共振波導(dǎo)光柵傳感器的二相表型藥理鑒別法，

(1)藥材的提取

精密稱定1g藥材粉末，置錐形瓶中，加入10mL濃度為2mol/L的鹽酸溶液，超聲處理，功率250W，頻率40kHz，30分鐘，放冷，濾過，濾渣和濾器用10mL上述鹽酸溶液分?jǐn)?shù)次洗滌，合并濾液和洗液，用濃氨試液調(diào)節(jié)pH值至9，用三氯甲烷振搖提取4次，每次10mL，合并三氯甲烷，回收溶劑至干，殘?jiān)镁彌_液溶解，轉(zhuǎn)移至5mL量瓶中，加緩沖液至刻度，搖勻，濾過，取續(xù)濾液用于測試；

(2)用共振波導(dǎo)光柵傳感器檢測藥材提取液刺激CHO-M₂細(xì)胞所產(chǎn)生的藥理表型

取20μL CHO-M₂細(xì)胞懸液接種在細(xì)胞測試板中，放入含有5％二氧化碳、溫度為37℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)14小時(shí)，取出細(xì)胞測試板，移除培養(yǎng)基，用移液槍向每個(gè)孔中加入20μL Hank's平衡鹽溶液，將測試板放入Corning Epic BT系統(tǒng)進(jìn)行信號平衡，1小時(shí)后，將基線歸零并啟動(dòng)一個(gè)新的信號記錄程序，記錄2分鐘后，暫停程序，用排槍將10μL提取液加入每個(gè)微孔中，并繼續(xù)記錄1小時(shí)；如果加入藥材提取液后檢測信號超過100pm，則該表型記為1；若信號在-100到100之間，則該表型記為0；若信號小于-100，則該表型記為-1；藥材提取液在該階段所產(chǎn)生的動(dòng)態(tài)質(zhì)量再分布信號即為第一相表型；

(3)用共振波導(dǎo)光柵傳感器檢測乙酰膽堿和藥材提取液共同刺激CHO-M₂細(xì)胞所產(chǎn)生的整合藥理表型

在上述記錄程序結(jié)束后，重新開始一個(gè)程序；信號記錄2分鐘后暫停程序，用排槍向每個(gè)孔中加入10μL濃度為16μM的乙酰膽堿Hank's平衡鹽溶液，然后繼續(xù)記錄程序1小時(shí)，如果加入乙酰膽堿溶液后信號超過100pm，則該表型記為1；若信號在-100到100之間，則該表型記為0；若信號小于-100，則該表型記為-1；該階段產(chǎn)生的動(dòng)態(tài)質(zhì)量再分布信號即為第二相表型；

(4)整合第(2)、(3)步的表型，并與洋金花藥材表型進(jìn)行比對

如果滿足(1, 0)則為洋金花，其中“ 1”為步驟(2)的表型，“ 0”為步驟(3)的表型，否則，即為偽品藥材；

(5)基于共振波導(dǎo)光柵傳感器的二相表型藥理鑒別法與HPLC的聯(lián)合用于鑒定洋金花藥材質(zhì)量

按照如下條件對洋金花進(jìn)行HPLC分析，將成分的峰面積或含量與藥材活性值進(jìn)行關(guān)聯(lián)；

流動(dòng)相A：含有0.0025mol/L庚烷磺酸鈉的水溶液，用磷酸調(diào)至pH＝5；

流動(dòng)相B：乙腈；

分離條件為(以B％表示)：

0-13min，16-16％；

13-20min，16-18％；

20-28min，18-18％；

28-30min，18-20％；

30-42min，20-20％；

42-60min，20-25％；

流速為1.0mL/min；

檢測波長為215nm。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的洋金花藥材的鑒別方法，其特征在于，CHO-M₂細(xì)胞是指能夠穩(wěn)定表達(dá)毒蕈堿M₂型膽堿受體的中國倉鼠卵巢細(xì)胞。

3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的洋金花藥材的鑒別方法，其特征在于，步驟(1)所述的緩沖液為Hank's平衡鹽溶液。

4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的洋金花藥材的鑒別方法，其特征在于，步驟(2)所述的培養(yǎng)基為含有10％胎牛血清、80U/mL青霉素、0.08mg/mL鏈霉素、0.4mg/mL遺傳霉素和0.08mg/mL博來霉素的HyClone Ham's F-12營養(yǎng)液。

5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的洋金花藥材的鑒別方法，其特征在于，步驟(2)所述的CHO-M₂細(xì)胞密度為2,5000個(gè)/孔。

6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的洋金花藥材的鑒別方法，其特征在于，步驟(2)所述的細(xì)胞測試版為Epic 384孔細(xì)胞測試板或纖維蛋白覆蓋的Epic 384孔細(xì)胞測試板。