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[發明專利]一種洋金花藥材的鑒別方法有效

專利信息
申請號: 201710076392.3 申請日: 2017-02-13
公開(公告)號: CN106770037B 公開(公告)日: 2018-02-27
發明(設計)人: 李萍;趙小艾;屠禮凡;宋慧鵬;王紅 申請(專利權)人: 中國藥科大學
主分類號: G01N21/41 分類號: G01N21/41;G01N30/02
代理公司: 南京匯盛專利商標事務所(普通合伙)32238 代理人: 趙超
地址: 211198 江蘇*** 國省代碼: 江蘇;32
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摘要:
搜索關鍵詞: 一種 洋金花 藥材 鑒別方法
【權利要求書】:

1.一種洋金花藥材的鑒別方法,其特征是:包括:

基于共振波導光柵傳感器的二相表型藥理鑒別法,

(1)藥材的提取

精密稱定1g藥材粉末,置錐形瓶中,加入10mL濃度為2mol/L的鹽酸溶液,超聲處理,功率250W,頻率40kHz,30分鐘,放冷,濾過,濾渣和濾器用10mL上述鹽酸溶液分數次洗滌,合并濾液和洗液,用濃氨試液調節pH值至9,用三氯甲烷振搖提取4次,每次10mL,合并三氯甲烷,回收溶劑至干,殘渣用緩沖液溶解,轉移至5mL量瓶中,加緩沖液至刻度,搖勻,濾過,取續濾液用于測試;

(2)用共振波導光柵傳感器檢測藥材提取液刺激CHO-M2細胞所產生的藥理表型

取20μL CHO-M2細胞懸液接種在細胞測試板中,放入含有5%二氧化碳、溫度為37℃的培養箱中培養14小時,取出細胞測試板,移除培養基,用移液槍向每個孔中加入20μL Hank's平衡鹽溶液,將測試板放入Corning Epic BT系統進行信號平衡,1小時后,將基線歸零并啟動一個新的信號記錄程序,記錄2分鐘后,暫停程序,用排槍將10μL提取液加入每個微孔中,并繼續記錄1小時;如果加入藥材提取液后檢測信號超過100pm,則該表型記為1;若信號在-100到100之間,則該表型記為0;若信號小于-100,則該表型記為-1;藥材提取液在該階段所產生的動態質量再分布信號即為第一相表型;

(3)用共振波導光柵傳感器檢測乙酰膽堿和藥材提取液共同刺激CHO-M2細胞所產生的整合藥理表型

在上述記錄程序結束后,重新開始一個程序;信號記錄2分鐘后暫停程序,用排槍向每個孔中加入10μL濃度為16μM的乙酰膽堿Hank's平衡鹽溶液,然后繼續記錄程序1小時,如果加入乙酰膽堿溶液后信號超過100pm,則該表型記為1;若信號在-100到100之間,則該表型記為0;若信號小于-100,則該表型記為-1;該階段產生的動態質量再分布信號即為第二相表型;

(4)整合第(2)、(3)步的表型,并與洋金花藥材表型進行比對

如果滿足(1, 0)則為洋金花,其中“ 1”為步驟(2)的表型,“ 0”為步驟(3)的表型,否則,即為偽品藥材;

(5)基于共振波導光柵傳感器的二相表型藥理鑒別法與HPLC的聯合用于鑒定洋金花藥材質量

按照如下條件對洋金花進行HPLC分析,將成分的峰面積或含量與藥材活性值進行關聯;

流動相A:含有0.0025mol/L庚烷磺酸鈉的水溶液,用磷酸調至pH=5;

流動相B:乙腈;

分離條件為(以B%表示):

0-13min,16-16%;

13-20min,16-18%;

20-28min,18-18%;

28-30min,18-20%;

30-42min,20-20%;

42-60min,20-25%;

流速為1.0mL/min;

檢測波長為215nm。

2.根據權利要求1所述的洋金花藥材的鑒別方法,其特征在于,CHO-M2細胞是指能夠穩定表達毒蕈堿M2型膽堿受體的中國倉鼠卵巢細胞。

3.根據權利要求1所述的洋金花藥材的鑒別方法,其特征在于,步驟(1)所述的緩沖液為Hank's平衡鹽溶液。

4.根據權利要求1所述的洋金花藥材的鑒別方法,其特征在于,步驟(2)所述的培養基為含有10%胎牛血清、80U/mL青霉素、0.08mg/mL鏈霉素、0.4mg/mL遺傳霉素和0.08mg/mL博來霉素的HyClone Ham's F-12營養液。

5.根據權利要求1所述的洋金花藥材的鑒別方法,其特征在于,步驟(2)所述的CHO-M2細胞密度為2,5000個/孔。

6.根據權利要求1所述的洋金花藥材的鑒別方法,其特征在于,步驟(2)所述的細胞測試版為Epic 384孔細胞測試板或纖維蛋白覆蓋的Epic 384孔細胞測試板。

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