[發(fā)明專利]一種以胎盤為來源的造血干細(xì)胞提取及凍存方法有效
| 申請?zhí)枺?/td> | 201710074244.8 | 申請日： | 2017-02-10 |
| 公開（公告）號： | CN107058224B | 公開（公告）日： | 2020-08-21 |
| 發(fā)明（設(shè)計）人： | 王進(jìn)輝;李東升;許峻榮;陳智聰;楊陽;鐘翠婷;于莉 | 申請（專利權(quán)）人： | 廣東唯泰生物科技有限公司 |
| 主分類號： | C12N5/0789 | 分類號： | C12N5/0789;A01N1/02 |
| 代理公司： | 廣州新諾專利商標(biāo)事務(wù)所有限公司 44100 | 代理人： | 許英偉 |
| 地址： | 528251 廣東省佛山*** | 國省代碼： | 廣東;44 |
| 權(quán)利要求書： | 查看更多 | 說明書： | 查看更多 |
| 摘要： | |||
| 搜索關(guān)鍵詞： | 一種 胎盤 來源 造血 干細(xì)胞 提取 方法 | ||
1.一種以胎盤為來源的造血干細(xì)胞提取方法，其特征在于，包括：
步驟A、對采集到的胎盤及母血進(jìn)行清洗和檢測；
步驟B、用灌洗液對檢測合格的胎盤分多次進(jìn)行灌洗得到含造血干細(xì)胞的灌洗液；
步驟C、對提取到的含造血干細(xì)胞的灌洗液進(jìn)行濃縮純化，得到造血干細(xì)胞群；
所述步驟B中，分三次進(jìn)行灌洗，其中，第一次灌洗過程的灌洗液為：含有5～10％胎牛血清、0.1～0.5mg/mL肝素鈉、0.01～0.1mg/mL酚妥拉明、0.01～0.1mg/mL氯丙嗪的基礎(chǔ)培養(yǎng)基灌洗液；
第二次灌洗過程的灌洗液為：含有5～10％胎牛血清、0.1～0.5mg/mL肝素鈉、0.005～0.1mg/mL趨化因子受體拮抗劑、0.005～0.1mg/mL粒細(xì)胞集落刺激因子的基礎(chǔ)培養(yǎng)基灌洗液；
第三次灌洗過程的灌洗液為：含有0.1～0.5mg/mL肝素鈉、0.01～0.05mg/mL膠原酶Ⅷ、0.01-0.03mg/mL胰酶的生理鹽水灌洗液；
第一次灌洗過程的條件為：以每秒鐘3滴灌洗液的速度灌洗2小時，灌洗1000mL灌洗液；
第二次灌洗過程的條件為：以每秒鐘3滴灌洗液的速度灌洗3小時，灌洗1500mL灌洗液；
第三次灌洗過程的條件為：以每秒鐘3滴灌洗液的速度持續(xù)灌洗，至臍靜脈流出來的液體為粉紅色酶解液時，結(jié)扎動靜脈，然后置于室溫酶解1h，之后解開動靜脈繼續(xù)灌洗1000mL灌洗液。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的以胎盤為來源的造血干細(xì)胞提取方法，其特征在于，步驟A具體包括：
A1、先用75％酒精噴灑胎盤外表面1～5min，再用組織保護(hù)液清洗胎盤外表面的殘留血液和血凝塊，得到胎盤和母血樣本；
A2、對所述胎盤和母血樣本進(jìn)行健康指標(biāo)檢測。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的以胎盤為來源的造血干細(xì)胞提取方法，其特征在于，步驟B具體包括：
B1、將注入軟管頭插入胎盤臍動脈中，并將回收軟管頭插入臍靜脈中，再用止血鉗夾緊；
B2、將灌洗液通過注入軟管頭注入胎盤，然后通過回收軟管頭來回收，得到含造血干細(xì)胞的灌洗液；
B3、重復(fù)上述步驟B2，并將獲得的含造血干細(xì)胞的灌洗液混合。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的以胎盤為來源的造血干細(xì)胞提取方法，其特征在于，步驟C具體包括：
C1、對含造血干細(xì)胞的灌洗液進(jìn)行離心、分離處理，獲得白細(xì)胞層；
C2、對所述白細(xì)胞層進(jìn)行多次離心，獲得造血干細(xì)胞群；
C3、用基礎(chǔ)培養(yǎng)基對所述的造血干細(xì)胞群進(jìn)行重懸，并對其進(jìn)行計數(shù)和檢測。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的以胎盤為來源的造血干細(xì)胞提取方法，其特征在于，所述步驟C之后還包括：
D、采用程序控溫法對造血干細(xì)胞群進(jìn)行凍存。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的以胎盤為來源的造血干細(xì)胞提取方法，其特征在于，所述步驟D中，在凍存前對造血干細(xì)胞群進(jìn)行預(yù)處理，預(yù)處理過程包括：
第一預(yù)處理步驟，使用基礎(chǔ)培養(yǎng)基將造血干細(xì)胞群沉淀重懸至20ml，并將重懸得到的造血干細(xì)胞群重懸液用注射器吸取并緩慢注入至凍存袋內(nèi)，將凍存袋用冰袋冰浴至4℃；
第二預(yù)處理步驟，向所述凍存袋內(nèi)緩慢加入5ml細(xì)胞凍存混合液，在搖晃凍存袋的同時排出凍存袋和管道內(nèi)的空氣并封口。
7.根據(jù)權(quán)利要求5所述的以胎盤為來源的造血干細(xì)胞提取方法，其特征在于，所述程序控溫過程具體為：
第一控溫階段，先于4℃平衡30min，然后以1℃/min的速度降至-6℃，再以25℃/min的速度降至-50℃；
第二控溫階段，以10℃/min的速度升溫至-14℃；
第三控溫階段，以1℃/min的速度降至-45℃，接著以10℃/min的速度降至-90℃，最后于-196℃長期保存。
8.根據(jù)權(quán)利要求6所述的以胎盤為來源的造血干細(xì)胞提取方法，其特征在于，上述造血干細(xì)胞群置于-196℃的液氮中進(jìn)行保存。
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