[發明專利]一種G-四聯體增強型膠體金層析試紙條

在審

• 申請號: 201710070859.3
• 申請日: 2017-02-09
• 公開（公告）號: CN108414746A
• 公開（公告）日: 2018-08-17
• 發明（設計）人: 許文濤
• 申請（專利權）人: 北京言必信科技有限公司;中國農業大學
• 主分類號: G01N33/558
• 分類號: G01N33/558;G01N33/543
• 代理公司: 北京華仲龍騰專利代理事務所(普通合伙) 11548
• 代理人: 黃玉玨

1.一種G-四聯體增強型膠體金層析試紙條，以膠體金顆粒作為信號，其特征在于：試紙條包括樣品墊、結合墊、硝酸纖維素膜、吸收墊和背板，所述背襯上依次粘附有樣品墊、結合墊、硝酸纖維素膜、吸收墊；所述結合墊粘附于所述樣品墊之上，并與所述反應墊相搭接；所述反應墊與所述吸收墊相搭接；將可以特異性識別的抗體或核酸以條帶狀固定在硝酸纖維素膜上，并將G-四聯體與抗體或核酸的膠體金復合物吸附在結合墊上，所述硝酸纖維素膜上具有檢測線和質控線；所述檢測帶與所述質控帶的距離為5mm～10mm。

2.根據權利要求1所述的G-四聯體增強型膠體金層析試紙條，其特征在于：不同種類的生色底物均可以用于G-四聯體增強型膠體金層析試紙條，包括2'-聯氨-雙(3-乙基苯并賽唑啉-6-磺酸)-二胺鹽(ABTS)、3,3',5,5'-四甲基聯苯胺(TMB)、3-氨基-9-乙基咔唑(AEC)、鄰苯二胺(OPD)、二氨基聯苯胺(DAB)，其中，AEC的增強效果最為明顯。

3.根據權利要求1所述的G-四聯體增強型膠體金層析試紙條，其特征在于：所述G-四聯體與抗體或核酸的膠體金復合物合成步驟為：

1)膠體金顆粒的制備

將50mL的2.4×10^-4M HAuCl₄水溶液加熱至沸騰，然后加入1.67mL的1％檸檬三鈉，將沸騰溶液再攪拌30分鐘，然后在使用前在4℃下儲存；

2)G-四聯體與膠體金復合物的制備：

G-四聯體的DNA序列為/SH C6/-AAAAAACTGGGAGGGAGGGAGGG，20μL的100mM G-四聯體DNA溶液與980μL的上述膠體金溶液混合并持續攪拌，緩慢加入50mM的NaCl并孵育12h，然后，將溶液在12000×g下離心20min，所得沉淀即為G-四聯體與膠體金復合物；

3)G-四聯體與抗體的膠體金復合物的制備

將20μL的1mg/mL抗體溶液1mL與980μL的上述G-四聯體與膠體金復合物溶液混合并持續攪拌，繼續加入20μL的10％BSA溶液攪拌30min.然后，將溶液在12,000×g下離心20min，所得沉淀即為G-四聯體與抗體的膠體金復合物并在4℃下保存在Tris-HAc緩沖液中；

4)G-四聯體與核酸的膠體金復合物的制備

20μL的100mM核酸探針溶液與980μL的上述G-四聯體與膠體金復合物溶液混合并持續攪拌，緩慢加入50mM的NaCl并孵育12h，然后，將溶液在12,000×g下離心20min，所得沉淀即為G-四聯體與核酸的膠體金復合物并在4℃下保存在Tris-HAc緩沖液中。

4.權利要求1所述的一種G-四聯體增強型膠體金層析試紙條的檢測步驟，包括以下步驟：

1)待測樣品的制備：根據樣品特征和檢測原理的差異，將其制備成溶液狀態，當待測物為蛋白時或小分子時，可以通過將樣品均質后直接獲得，當待測物為核酸時，待測樣品的制備可通過DNA提取和核酸擴增的步驟獲得；

2)檢測緩沖液的制備：將5μL G-四聯體與抗體或核酸的膠體金復合物加入140μL磷酸鹽緩沖液中，然后加入10μL的1μM凝血酶，并將混合溶液在37℃在孵育20min，最后加入10μL的2μM生色底物以及2μM過氧化氫，繼續37℃在孵育10min，所得溶液即為檢測緩沖液；

3)檢測步驟：將25μL的待測樣品溶液與175μL的檢測緩沖液混合滴加在G-四聯體增強型膠體金層析試紙條的樣品墊上，在毛細管力的作用下，流經硝酸纖維素膜后再檢測線和質控線上形成可以肉眼識別的條帶，全過程可在5min內完成。