[發明專利]羅非魚源無乳鏈球菌重組CBP蛋白疫苗的制備方法及其應用

在審

• 申請號: 201710070035.6
• 申請日: 2017-01-19
• 公開（公告）號: CN106834308A
• 公開（公告）日: 2017-06-13
• 發明（設計）人: 李安興;李云
• 申請（專利權）人: 中山大學
• 主分類號: C12N15/31
• 分類號: C12N15/31;C07K14/315;C12N15/70;A61K39/09;A61P31/04;C12R1/46
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技術領域

本發明屬于分子疫苗學技術領域。更具體地，涉及一種羅非魚源無乳鏈球菌重組CBP蛋白疫苗的制備方法及其應用。

背景技術

無乳鏈球菌(Streptococcus agalactiae)是一種人畜魚共患革蘭氏陽性菌，能引起新生兒腦膜炎、牛乳腺炎和魚類腦膜腦炎。無乳鏈球菌能感染多種海水、淡水魚類并引起死亡，給我國乃至世界水產養殖業造成重大經濟損失。因此，研究無乳鏈球菌相關的防治技術具有很重要的現實意義。

目前，在國內已有一些與鏈球菌疫苗相關的專利。申請號：200580013779.X，發明名稱：無乳鏈球菌疫苗公布了一種β溶血性無乳鏈球菌的完整滅活細胞和該菌培養物的濃縮提取物制備的組合疫苗通過注射和浸泡兩種方式對羅非魚抗無乳鏈球菌的免疫保護效果分別為80％和35％。申請號：200780025577.6，發明名稱：抗鏈球菌的聯合疫苗公布了一種聯合疫苗，當難辨鏈球菌和海豚鏈球菌在疫苗制劑中的比例(基于細胞∶細胞)為20∶1或40∶1時，可得到抗難辨鏈球菌的64％的相對保護率和抗海豚鏈球菌的71％的相對保護率。申請號：201080047156.5，發明名稱：鏈球菌組合疫苗，公布了一種組合疫苗，包含無乳鏈球菌生物型1血清型Ia細胞和血清型III細胞的組合疫苗提供針對羅非魚抗無乳鏈球菌生物型1血清型Ia的88.9％保護率和抗羅非魚無乳鏈球菌生物型1血清型III的92％的保護率。申請號：201010207289.6，發明名稱：羅非魚二聯鏈球菌滅活疫苗的制備方法，公布了一種羅非魚無乳鏈球菌和海豚鏈球菌等體積混合二聯疫苗的制備過程。申請號：201210337267.0，發明名稱：一種預防羅非魚鏈球菌病的疫苗，公布了一種無乳鏈球菌全菌滅活疫苗通過浸泡、注射和口服免疫羅非魚后最高分別能達到60％、90％和75％的免疫保護率。申請號：201410121138.7，申請名稱：一種無乳鏈球菌的口服疫苗及其制備方法，構建一種表達無乳鏈球菌sip蛋白的重組減毒沙門氏菌，將其拌料投喂羅非魚后最高可獲得63％的抗無乳鏈球菌免疫保護率。

但是，以上公開使用的無乳鏈球菌疫苗均是單一或是二聯全菌滅活疫苗，制備出的疫苗免疫效力與疫苗菌株的免疫原性直接相關，并且只對血清型一致的無乳鏈球菌有效，對海豚鏈球菌沒有效果。

發明內容

本發明要解決的技術問題是克服上述現有技術的缺陷和不足，提供一種羅非魚源無乳鏈球菌Cbp基因編碼的重組CBP蛋白，并作為重組蛋白疫苗來防治羅非魚無乳鏈球菌病，能夠對羅非魚抗無乳鏈球菌不同血清型產生特異性的保護性。該重組蛋白疫苗的制備方法簡單、制備過程安全，疫苗對羅非魚抗無乳鏈球菌的免疫保護率達到56.35％±8.09％。

本發明的目的是提供一種羅非魚源無乳鏈球菌重組CBP蛋白疫苗的制備方法。

本發明另一目的是提供所述羅非魚源無乳鏈球菌重組CBP蛋白疫苗的應用。

本發明上述目的通過以下技術方案實現：

一種羅非魚源無乳鏈球菌Cbp基因，其核苷酸序列如序列1所示。

所述的羅非魚源無乳鏈球菌Cbp基因是從羅非魚源無乳鏈球菌中克隆得到的。

一種羅非魚源無乳鏈球菌Cbp基因編碼的重組CBP蛋白，其氨基酸序列如序列2所示。

所述重組CBP蛋白是由上述羅非魚源無乳鏈球菌Cbp基因編碼得到。

另外，上述羅非魚源無乳鏈球菌重組CBP蛋白的制備方法，包括如下步驟：

S1.利用引物對CBP-F和CBP-R，將Cbp基因克隆到原核表達系統中，得到含重組質粒pET28a-CBP的工程菌；

S2.將含重組質粒pET28a-CBP的工程菌進行擴大培養，純化回收獲得重組CBP蛋白；

其中，所述引物CBP-F的序列如序列3所示，引物CBP-R的序列如序列4所示；所述Cbp基因的序列如序列1所示。

另外，進一步優選地，步驟S1的具體方法是：

S11.克隆Cbp基因：以羅非魚源無乳鏈球菌基因組DNA為模板，以引物CBP-F和CBP-R進行PCR克隆Cbp基因；

S12.構建CBP克隆菌株：將克隆的Cbp基因連接到pET28a載體，并轉化E.coli DH5α感受態細胞，利用卡那青霉素篩選得到含有重組質粒pET28a-CBP的陽性CBP菌株；