[發明專利]羅非魚源無乳鏈球菌重組CBP蛋白疫苗的制備方法及其應用

在審

• 申請號: 201710070035.6
• 申請日: 2017-01-19
• 公開（公告）號: CN106834308A
• 公開（公告）日: 2017-06-13
• 發明（設計）人: 李安興;李云
• 申請（專利權）人: 中山大學
• 主分類號: C12N15/31
• 分類號: C12N15/31;C07K14/315;C12N15/70;A61K39/09;A61P31/04;C12R1/46
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• 代理人: 暫無信息

1.一種羅非魚源無乳鏈球菌Cbp基因，其特征在于，其核苷酸序列如序列1所示。

2.一種羅非魚源無乳鏈球菌重組CBP蛋白，其特征在于，其氨基酸序列如序列2所示。

3.根據權利要求1所述羅非魚源無乳鏈球菌重組CBP蛋白，其特征在于，所述重組CBP蛋白是由權利要求1中所述羅非魚源無乳鏈球菌Cbp基因編碼得到。

4.權利要求2或3所述羅非魚源無乳鏈球菌重組CBP蛋白的制備方法，其特征在于，包括如下步驟：

S1.利用引物對CBP-F和CBP-R，將CBP基因克隆到原核表達系統中，得到含重組質粒pET28a-CBP的工程菌；

S2.將含重組質粒pET28a-CBP的工程菌進行擴大培養，純化回收獲得重組CBP蛋白；

其中，所述引物CBP-F的序列如序列3所示，引物CBP-R的序列如序列4所示；所述Cbp基因的序列如序列1所示。

5.根據權利要求4所述的制備方法，其特征在于，步驟S1的具體方法是：

S11.克隆Cbp基因：以羅非魚源無乳鏈球菌基因組DNA為模板，以引物CBP-F和CBP-R進行PCR克隆Cbp基因；

S12.構建CBP克隆菌株：將克隆的Cbp基因連接到pET28a載體，并轉化E.coli DH5α感受態細胞，利用卡那青霉素篩選得到含有重組質粒pET28a-CBP的陽性CBP菌株；

S13.構建CBP表達菌株：將重組質粒pET28a-CBP轉化E.coli BL21(DE3)感受態細胞，經卡那青霉素抗性篩選，挑取單菌落進行PCR鑒定，篩選出陽性克隆細胞，即為含重組質粒pET28a-CBP的工程菌。

6.根據權利要求4所述的制備方法，其特征在于，步驟S2的具體方法如下：

S21.將含有重組質粒pET28a-CBP的工程菌單菌落接種于含有卡那霉素的LB液體培養基中，震蕩培養10h；

S22.將菌液加入含有卡那霉素的LB液體培養基中，擴大培養2h，至OD600為0.6；

S23.向菌液中加入IPTG誘導培養后，利用咪唑洗脫液純化回收，得到純化的重組CBP蛋白，即為所述羅非魚源無乳鏈球菌重組CBP蛋白。

7.權利要求2或3所述羅非魚源無乳鏈球菌重組CBP蛋白在作為或制備羅非魚源無乳鏈球菌重組CBP蛋白疫苗方面的應用。

8.一種羅非魚源無乳鏈球菌重組CBP蛋白疫苗的制備方法，其特征在于，是將羅非魚源無乳鏈球菌重組CBP蛋白用滅菌PBS稀釋至1mg/ml，與弗氏完全或不完全佐劑按1∶1混合均勻，制備成亞單位疫苗。

9.根據權利要求8所述方法制備得到的羅非魚源無乳鏈球菌重組CBP蛋白疫苗。

10.權利要求9所述羅非魚源無乳鏈球菌重組CBP蛋白疫苗在制備防治羅非魚無乳鏈球菌病的藥物或制劑方面的應用。