[發(fā)明專(zhuān)利]一種重組酵母菌株及其應(yīng)用

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201710069084.8
• 申請(qǐng)日: 2017-02-08
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN106754448B
• 公開(kāi)（公告）日: 2020-07-21
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 李霞;陳艷;肖文海;王穎;姚明東;元英進(jìn)
• 申請(qǐng)（專(zhuān)利權(quán)）人: 天津大學(xué)
• 主分類(lèi)號(hào): C12N1/19
• 分類(lèi)號(hào): C12N1/19;C12N9/14;C12N9/88;C12N9/04;C12P7/04;C12P5/00;C12P7/64;C12P7/40;C12P33/00;C12R1/865
• 代理公司: 北京集佳知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司 11227
• 代理人: 趙青朵

本發(fā)明涉及基因工程技術(shù)領(lǐng)域，公開(kāi)了一種重組酵母菌株及其應(yīng)用。本發(fā)明所述重組酵母菌株為發(fā)酵生產(chǎn)香葉醇、香葉基香葉醇、青蒿二烯、脂肪酸、酵母固醇中一種或兩種以上產(chǎn)物的酵母菌株，并且敲除YPL062W基因。本發(fā)明發(fā)掘了酵母中YPL062W基因的具體生物學(xué)功能，通過(guò)敲除該基因可顯著提高相應(yīng)發(fā)酵酵母菌株在香葉醇、香葉基香葉醇、青蒿二烯、脂肪酸、酵母固醇和脂肪酸產(chǎn)量，可作為一種優(yōu)化酵母底盤(pán)細(xì)胞的新途徑，應(yīng)用于微生物發(fā)酵領(lǐng)域。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及基因工程技術(shù)領(lǐng)域，更具體的說(shuō)是涉及一種重組酵母菌株及其應(yīng)用。

背景技術(shù)

香葉醇、香葉基香葉醇、青蒿二烯、脂肪酸以及酵母固醇具有重要的藥用價(jià)值和經(jīng)濟(jì)價(jià)值，然而由于植物資源稀缺、活性物質(zhì)含量低、化學(xué)合成難度大等因素，限制了這些物質(zhì)在醫(yī)藥等領(lǐng)域中的廣泛應(yīng)用。

合成生物細(xì)胞工廠(chǎng)針對(duì)宿主細(xì)胞(微生物等)和目標(biāo)生物合成路徑進(jìn)行有目標(biāo)地改造產(chǎn)生直接效益，能夠降低生產(chǎn)成本、縮短生產(chǎn)周期，因此運(yùn)用合成生物細(xì)胞工廠(chǎng)高效生產(chǎn)上述化合物，具有十分廣闊的應(yīng)用前景。釀酒酵母是公認(rèn)安全的模式微生物，它生長(zhǎng)周期短且容易高密度培養(yǎng)，可作食用、藥用酵母，是上述物質(zhì)合成的非常優(yōu)秀的宿主。

目前合成生物細(xì)胞工廠(chǎng)存在的關(guān)鍵科學(xué)問(wèn)題是宿主細(xì)胞與異源生物合成路徑間的適配。一方面異源生物合成路徑本身的代謝通量決定目標(biāo)產(chǎn)物的產(chǎn)量，因此需要優(yōu)化異源路徑，包括優(yōu)化異源基因的表達(dá)、基因來(lái)源的篩選、胞內(nèi)前體物質(zhì)供給等；另一方面來(lái)自宿主細(xì)胞固有的代謝和調(diào)控系統(tǒng)也會(huì)影響目標(biāo)生物合成路徑的生產(chǎn)能力，這就需要對(duì)底盤(pán)細(xì)胞進(jìn)行深入系統(tǒng)的優(yōu)化。

發(fā)明內(nèi)容

有鑒于此，本發(fā)明的目的在于提供一種重組酵母菌株，使得所述酵母菌株能夠顯著提高香葉醇、香葉基香葉醇、青蒿二烯、脂肪酸以及酵母固醇的產(chǎn)量，同時(shí)提供該菌株的應(yīng)用和發(fā)酵方法。

為實(shí)現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明提供如下技術(shù)方案：

一種重組酵母菌株，所述酵母菌株為發(fā)酵生產(chǎn)香葉醇、香葉基香葉醇、青蒿二烯、脂肪酸、酵母固醇中一種或兩種以上產(chǎn)物的酵母菌株，并且敲除YPL062W基因。

本發(fā)明通過(guò)研究發(fā)現(xiàn)，生產(chǎn)香葉醇、香葉基香葉醇、青蒿二烯、脂肪酸、酵母固醇產(chǎn)物的酵母菌株中YPL062W基因，能夠影響目標(biāo)產(chǎn)物的產(chǎn)量，通過(guò)敲除該基因，相對(duì)于未敲除菌株能夠顯著提高目標(biāo)產(chǎn)物的產(chǎn)量。

在本發(fā)明具體實(shí)施方式中，本發(fā)明分別以發(fā)酵生產(chǎn)香葉醇、香葉基香葉醇、青蒿二烯、脂肪酸、酵母固醇的酵母菌株進(jìn)行搖瓶發(fā)酵試驗(yàn)，為了能夠發(fā)酵生產(chǎn)目標(biāo)產(chǎn)物，各酵母菌株需要引入一些必須的外源基因元件。其中，所述發(fā)酵生產(chǎn)香葉醇的酵母菌株包含經(jīng)酵母自身同源重組整合到其基因組上的如下基因片段：

酵母trp1位點(diǎn)上游同源序列、GAL1啟動(dòng)子、香葉醇合成酶編碼基因GES、PGK1終止子、酵母trp1位點(diǎn)下游同源序列順次拼接而成的基因片段1，示意圖見(jiàn)圖1，香葉醇合成酶編碼基因GES優(yōu)選為來(lái)源于長(zhǎng)春花(Catharanthusroseus)；

酵母leu2位點(diǎn)上游同源序列、LEU2標(biāo)記、ACT1終止子、截短的HMG-CoA還原酶基因tHMGR1、GAL10啟動(dòng)子、酵母leu2位點(diǎn)下游同源序列順次拼接而成的基因片段2，示意圖見(jiàn)圖2。

所述發(fā)酵生產(chǎn)青蒿二烯的酵母菌株包含經(jīng)酵母自身同源重組整合到其基因組上的如下基因片段：

酵母leu2位點(diǎn)上游同源序列、LEU2標(biāo)記、ACT1終止子、截短的HMG-CoA還原酶基因tHMGR1、GAL10啟動(dòng)子、酵母leu2位點(diǎn)下游同源序列順次拼接而成的基因片段2；

酵母trp1位點(diǎn)上游同源序列、GAL1啟動(dòng)子、青蒿二烯合成酶編碼基因ADS、PGK1終止子、酵母trp1位點(diǎn)下游同源序列順次拼接而成的基因片段3，示意圖見(jiàn)圖3，青蒿二烯合成酶編碼基因ADS優(yōu)選為來(lái)源于青蒿(Artemisiaannua)。