[發(fā)明專利]嵌合抗原受體及其基因和重組表達(dá)載體、CARHER2-NKT細(xì)胞及其制備方法和應(yīng)用

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• 申請?zhí)枺?/td>: 201710068756.3
• 申請日: 2017-02-08
• 公開（公告）號: CN108395480A
• 公開（公告）日: 2018-08-14
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 王曉慧;列浦昌
• 申請（專利權(quán)）人: 廣州百尼夫生物科技有限公司
• 主分類號: C07K19/00
• 分類號: C07K19/00;C12N15/62;C12N15/867;C12N5/10;A61K35/17;A61P35/00
• 代理公司: 北京潤平知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司 11283
• 代理人: 蒲琳;王崇

1.一種嵌合抗原受體，其特征在于，所述嵌合抗原受體為HER2ScFv-CD8-CD137-CD3ζ，包括串聯(lián)的CD8a信號肽、HER2ScFv、縮短CD8的鉸鏈區(qū)和跨膜區(qū)、CD137的胞內(nèi)信號結(jié)構(gòu)域和CD3ζ的胞內(nèi)信號結(jié)構(gòu)域；優(yōu)選地，所述嵌合抗原受體具有如SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列，進(jìn)一步優(yōu)選地，所述嵌合抗原受體的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

2.編碼權(quán)利要求1所述的嵌合抗原受體的基因，優(yōu)選地，所述基因具有如SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列，進(jìn)一步優(yōu)選地，所述基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

3.含有權(quán)利要求2所述的基因的重組表達(dá)載體，優(yōu)選地，所述重組表達(dá)載體為慢病毒表達(dá)載體，進(jìn)一步優(yōu)選地，所述慢病毒表達(dá)載體為pWPT-HER2ScFv-CD8-CD137-CD3ζ。

4.一種工程化HER2靶向性的NKT細(xì)胞，其特征在于，所述NKT細(xì)胞是由權(quán)利要求1所述的嵌合抗原受體修飾的NKT細(xì)胞。

5.一種工程化HER2靶向性的NKT細(xì)胞的制備方法，其特征在于，所述方法包括：

包裝攜帶pWPT-HER2ScFv-CD8-CD137-CD3ζ的慢病毒，得到病毒濃縮液；利用得到的病毒濃縮液感染NKT細(xì)胞，使NKT細(xì)胞表達(dá)嵌合抗原受體HER2ScFv-CD8-CD137-CD3ζ。

6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其中，所述方法還包括通過如下方法制備NKT細(xì)胞：

(1)在CD3單克隆抗體、白介素-2和白介素-15存在下，將單個核細(xì)胞進(jìn)行第一階段培養(yǎng)；優(yōu)選地，所述第一階段培養(yǎng)的實施方式包括：將單個核細(xì)胞培養(yǎng)于第一NKT細(xì)胞培養(yǎng)液中，所述第一NKT細(xì)胞培養(yǎng)液含有NKT細(xì)胞培養(yǎng)基、CD3單克隆抗體、白介素-2和白介素-15；進(jìn)一步優(yōu)選地，第一NKT細(xì)胞培養(yǎng)液中，所述CD3單克隆抗體的濃度為30-70ng/mL，和/或所述白介素-2的濃度為300-700U/mL，和/或所述白介素-15的濃度為30-70ng/mL；

(2)在白介素-2存在下，將所述第一階段培養(yǎng)的細(xì)胞進(jìn)行第二階段培養(yǎng)；優(yōu)選地，所述第二階段培養(yǎng)的實施方式包括：將所述第一階段培養(yǎng)的細(xì)胞培養(yǎng)于第二NKT細(xì)胞培養(yǎng)液中，所述第二NKT細(xì)胞培養(yǎng)液中含有NKT細(xì)胞培養(yǎng)基和白介素-2；進(jìn)一步優(yōu)選地，第二NKT細(xì)胞培養(yǎng)液中，所述白介素-2的濃度為300-700U/mL。

7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其中，所述感染NKT細(xì)胞的方法包括：

(1)在病毒濃縮液、魚精蛋白和白介素-2存在下，將NKT細(xì)胞進(jìn)行第一階段感染培養(yǎng)；優(yōu)選地，所述第一階段感染培養(yǎng)的實施方式包括：將NKT細(xì)胞培養(yǎng)于第三NKT細(xì)胞培養(yǎng)液中，所述第三NKT細(xì)胞培養(yǎng)液含有NKT細(xì)胞培養(yǎng)基、病毒濃縮液、魚精蛋白和白介素-2；進(jìn)一步優(yōu)選地，第三NKT細(xì)胞培養(yǎng)液中，所述白介素-2的濃度為300-700U/mL；

(2)在CD3單克隆抗體、白介素-2和白介素-15存在下，將所述第一階段感染培養(yǎng)的細(xì)胞進(jìn)行第二階段感染培養(yǎng)；優(yōu)選地，所述第二階段感染培養(yǎng)的實施方式包括：將所述第一階段感染培養(yǎng)的細(xì)胞培養(yǎng)于所述第一NKT細(xì)胞培養(yǎng)液中。

8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其中，所述感染NKT細(xì)胞的方法還包括：

(3)先在白介素-2存在下，將所述第二階段感染培養(yǎng)的細(xì)胞進(jìn)行體外誘導(dǎo)，待細(xì)胞的密度為80-90％時，再在CD3單克隆抗體、白介素-2和白介素-15存在下，將細(xì)胞進(jìn)行擴(kuò)增培養(yǎng)；優(yōu)選地，所述體外誘導(dǎo)的實施方式包括：將所述第二階段感染培養(yǎng)的細(xì)胞培養(yǎng)于所述第二NKT細(xì)胞培養(yǎng)液中，所述擴(kuò)增培養(yǎng)的實施方式包括：將細(xì)胞培養(yǎng)于所述第一NKT細(xì)胞培養(yǎng)液中。

9.權(quán)利要求5-8中任意一項所述方法制備得到的工程化HER2靶向性的NKT細(xì)胞。

10.權(quán)利要求4或9所述的工程化HER2靶向性的NKT細(xì)胞在制備用于治療腫瘤的制劑中的應(yīng)用，優(yōu)選地，所述腫瘤是進(jìn)展期HER2陽性的上皮腫瘤，進(jìn)一步優(yōu)選地，所述上皮腫瘤為膽管癌、胰腺癌、乳腺癌、卵巢癌、肺癌、肝癌、食管癌、前列腺癌、胃癌或口腔癌。