[發明專利]子宮內膜抗原的制備方法

有效

• 申請號: 201710068288.X
• 申請日: 2017-02-08
• 公開（公告）號: CN106841592B
• 公開（公告）日: 2019-03-29
• 發明（設計）人: 楊致亭;王好玉;馬金環;胡學亭;于剛;王婷
• 申請（專利權）人: 濰坊市康華生物技術有限公司
• 主分類號: C07K1/14
• 分類號: C07K1/14;G01N33/535
• 代理公司: 濰坊正信致遠知識產權代理有限公司 37255
• 代理人: 王偉霞

本發明屬于生物學檢測技術領域，具體提供了一種制備子宮內膜抗原的方法。本發明提供的方法是將牛的新鮮子宮內膜剝離，多次沖洗后加入膠原蛋白酶使子宮內膜上的膠原蛋白溶解，過篩網沖洗后，收集篩網上的子宮內膜腺體。在提前?20℃冰箱預冷的丙酮中，用組織勻漿器勻漿過濾，4℃電磁攪拌過夜，高速離心后棄沉淀，上清液用ProG親和吸附柱除去人血清中免疫球蛋白成分，制備成子宮內膜抗原。利用本發明的制備方法原料易得，工藝簡便快捷，成本低廉，可滿足臨床檢驗的需求。

技術領域

本發明涉及生物學檢測技術領域，具體涉及一種子宮內膜抗原的制備方法。

背景技術

目前臨床上用子宮內膜抗原檢測抗子宮內膜抗體，依此診斷子宮內膜的免疫病理損傷。其中在子宮內膜異位癥血清中，抗子宮內膜抗體檢出率達到70％-80％。這嚴重干擾妊娠導致不孕、停孕，甚至發生流產。另外初次妊娠時作了人工流產，胚囊也可能作為抗原刺激機體產生抗體，這種抗體繼而引發不孕。抗子宮內膜抗體陽性引起的不孕就是免疫不孕。

正常情況下，子宮內膜為胚胎著床和生長提供發育之地，未孕婦女子宮內膜在卵巢激素的調節下，產生周期性的剝脫，這并不會產生子宮內膜抗體。在某種病理狀態下如子宮內膜異位癥患者受到異位內膜的刺激，或者機體的免疫系統失常等因素導致誘發機體產生自身免疫反應，免疫應答紊亂后就產生抗子宮內膜抗體，影響患者的健康。

子宮內膜抗原主要存在子宮內膜腺體上皮細胞的胞液中，屬于糖蛋白，分子量為26-40kd，多見于分泌期子宮內膜中。南京軍區南京總醫院生殖遺傳研究室20世紀90年代從正常女性分泌期子宮內膜純化子宮內膜抗原，建立抗子宮內膜抗體作為早期診斷。但該方法使用原料為人的子宮內膜，取材不便，而且所得的抗原產品純度不高，因此建立用牛正常分泌期子宮內膜純化子宮內膜抗原成為一條可行的路徑。

發明內容

本發明的目的在于是：針對現有技術存在的不足，提供一種采用健康分泌期牛的子宮內膜制備子宮內膜抗原的方法，該方法取材方便，而且所得抗原對子宮內膜抗體有很好的特異性和敏感性。

為了實現上述實驗新型的目的，本發明的技術方案是：

子宮內膜抗原的制備方法，其特征在于所述制備方法包括以下步驟：

(1)膠原酶母液的配置：取膠原酶，然后用0.1M、pH為7.4的PBS緩沖液溶解，得到終濃度為10-20mg/ml的膠原酶母液；

(2)獲取子宮內膜腺體：將步驟(1)中的膠原酶母液稀釋，得到濃度1-2mg/ml的膠原酶稀釋液,然后取沖洗干凈的牛子宮內膜，按照料液比30-50:1的比例加入膠原酶稀釋液，在37℃水浴或者恒溫搖床上溫育消化4-48小時，在篩網上用沖洗液沖洗得到子宮內膜腺體；

(3)勻漿處理：取步驟(2)中的子宮內膜腺體，加入到-18～-22℃預冷的丙酮溶液中，勻漿處理60-120s，然后用濾紙過濾或布氏漏斗抽濾，去除濾液，收集過濾物；

(4)子宮內膜抗原的提取純化：取步驟(3)中的過濾物，用緩沖溶液溶解，攪拌過夜，離心處理得到的上清液用0.45um的濾膜過濾，然后再用ProG親和層析柱分離純化，收集蛋白峰出峰位置的流出液，濃縮得到子宮內膜抗原。

作為一種優選的技術方案，步驟(2)中的膠原酶稀釋液濃度為1mg/ml。

作為一種優選的技術方案，步驟(2)中的篩網為孔徑250um篩網、孔徑60um篩網、孔徑40um篩網中任意兩種。

作為一種優選的技術方案，步驟(3)中丙酮溶液的體積濃度為30％-50％。

作為一種改進的技術方案，步驟(4)中的緩沖溶液為0.01M-0.05M Tris、0.01M-0.05M EDTA、0.1M-0.15M氯化鈉、1mM-1.5mM PMSF、1mM-1.5mM DTT和1mM-1.5mM亞硫酸氫鈉的混合液。