[發明專利]一種香菇申香12號菌種的SSR標記指紋圖譜及其構建方法與應用

在審

• 申請號: 201710067948.2
• 申請日: 2017-02-07
• 公開（公告）號: CN106755511A
• 公開（公告）日: 2017-05-31
• 發明（設計）人: 譚琦;尚曉冬;宋春艷;章爐軍;董慧;張美彥;于海龍;姜寧;李玉;周峰
• 申請（專利權）人: 上海市農業科學院
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68
• 代理公司: 上海泰能知識產權代理事務所31233
• 代理人: 黃志達,魏峯

技術領域

本發明屬于香菇菌種的檢測領域，特別涉及一種香菇申香12號菌種的SSR標記指紋圖譜及其構建方法與應用。

背景技術

我國香菇產量已從1983年的1.95萬噸迅速發展到2015年的766萬噸，占全球香菇總產量的70％以上，改寫了世界食用菌產量的排行榜，并不斷縮小與排行第一的雙孢蘑菇產量差距，有專家預測，由于中國香菇產業的迅猛發展，在近10年內其將成為世界產量最高的食用菌。中國香菇以其驚人的發展速度，優質的品質及低廉的成本為世界菇業人士矚目，中國香菇已風靡世界。

優質菌種在香菇單產和質量中的貢獻率舉足輕重，這決定了香菇菌種在香菇產業中的重要地位。1999年我國簽署了《國際植物新品種保護法》，這不僅要求我們尊重其它國家的品種知識產權，同時也要加強保護我們國家自己的品種知識產權，為了建立食用菌新品種登記制度來真正保護我國的品種產權，必須首先建立成熟的品種鑒定技術，為新品種登記奠定基礎。尤其日本2004年4月1日開始實行《種苗法修正案》，對我國食用菌尤其是香菇的出口構成了極大的威脅。就國內而言，香菇栽培菌種“同種異名，異種同名”的現象，不僅給菇農帶來了極大的損失，影響了他們的栽培積極性，也極大地影響了中國香菇的快速發展；而且，隨著大規模的工廠化栽培方式的出現，對香菇栽培菌株質量的要求越來越高，需要發展更為簡便、快速、準確的菌株鑒定技術，以保證每批次的用種都準確無誤。

面對這種局勢，就需要進一步加快菌種鑒定技術的研究，在香菇的研究中引進更為有效的菌種鑒定體系。

發明內容

本發明所要解決的技術問題是提供一種香菇申香12號菌種的SSR標記指紋圖譜及其構建方法與應用，該指紋圖譜與常規形態學檢測、拮抗試驗、出菇試驗相比，具有檢測時間短，準確性高，重復性好的優點。

本發明的一種香菇申香12號菌種的SSR標記指紋圖譜，該指紋圖譜由8對SSR標記組成。SSR標記是基于香菇全基因組測序后開發的簡單重復序列片段(SSR)的擴增引物，經過對不同香菇品種進行PCR擴增后獲得的多態性標記。SSR標記具有擴增帶型好，重復性高的特點。本發明對大量的SSR引物進行了篩選，獲得了8對多態性高的引物，用這8對引物組合獲得的圖譜帶型，檢測目前我國主要栽培的40個香菇品種大多都具有專一性。這8對SSR標記的詳細信息如表1。

表1SSR標記詳細信息列表

本發明的一種香菇申香12號菌種的SSR標記指紋圖譜的構建方法，包括：

(1)菌絲培養：將香菇菌種轉接到馬鈴薯葡萄糖培養基PDB中，23-25℃下避光搖瓶培養，3-4d后收集菌絲；

(2)基因組DNA的提取：用CTAB(十六烷基三甲基溴化銨)法提取上述菌絲的基因組DNA，紫外分光光度法檢測總基因組DNA濃度和純度，調整樣品DNA的濃度一致；

(3)SSR分子標記的檢測：對上述提取的DNA進行8對SSR標記的PCR擴增；

(4)電泳檢測：將上述PCR擴增得到的產物與加樣緩沖液混勻，變性，點樣于變性聚丙烯酰胺凝膠上電泳，銀染，顯色，拍照，分析結果。

所述步驟(2)中的CTAB法提取菌絲的基因組DNA具體工藝包括：

(1)將-20℃冷凍干燥的香菇菌絲研磨成粉末，加入65℃預熱的2×CTAB抽提液，于65℃保溫45-60min，輕搖混勻；

(2)12000rpm、4℃離心20min，取上清液；

(3)在上述上清液中加入體積比為25∶24∶1的酚、氯仿和異戊醇的混合液，混勻10min，12000rpm、4℃離心10min，取上清液移入離心管中；

(4)在上述離心管中加入體積比為24∶1的氯仿和異戊醇混合液，混勻10min，12000rpm、4℃離心10min，取上清液移入另一離心管中；

(5)在上述離心管中加入2/3體積(相對于步驟(4)中的上清液)的-20℃預冷的異丙醇，搖動5min，8000rpm、4℃離心10min，去上清；

(6)將得到的沉淀用75vol％乙醇和10mmol/L醋酸鉀洗滌2-3次，每次8000rpm，室溫離心5min；

(7)加入預冷的95vol％乙醇，上下顛倒，8000rpm室溫離心10min，棄乙醇，真空抽干或自然晾干；

(8)加入100μL 1×TE(Tris/EDTA)緩沖液，使沉淀溶解；

(9)加入1μL 10mg/mL的RNaseA于37℃水浴1h，去除RNA；

(10)將得到的DNA提取物于-20℃貯藏備用。