[發明專利]一種香菇申香12號菌種的SSR標記指紋圖譜及其構建方法與應用

在審

• 申請號: 201710067948.2
• 申請日: 2017-02-07
• 公開（公告）號: CN106755511A
• 公開（公告）日: 2017-05-31
• 發明（設計）人: 譚琦;尚曉冬;宋春艷;章爐軍;董慧;張美彥;于海龍;姜寧;李玉;周峰
• 申請（專利權）人: 上海市農業科學院
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68
• 代理公司: 上海泰能知識產權代理事務所31233
• 代理人: 黃志達,魏峯

1.一種香菇申香12號菌種的SSR標記指紋圖譜，其特征在于：該指紋圖譜由8對SSR標記組成，具體序列如下：

1140正向引物：CCCAAAAAGGATTTCAGCAA；

反向引物：AACCGGAGTGGTGTAAGTGC；

76正向引物：AAGCAGGTCAGAGCAGGTTC；

反向引物：ACCGAGAGCAGAGTCGAGAG；

43正向引物：CTCTTTGCACCCTCAACCTC；

反向引物：CAGCAGTCTCCTCTTGGCTC；

16正向引物：ATAGGATGATTGAACGAGCAG；

反向引物：ACCGTAAGGTGGGAAGAAA；

19正向引物：ATGCCGTTCCAAAGATAC；

反向引物：TCTGTAACGCTTGTGGACTA；

148-1正向引物：CATTGCTCGGATCCTTCATT；

反向引物：CATTGCTCGGATCCTTCATT；

002正向引物：GGGCGAAACAATTTCAGGTA；

反向引物：ATGCCATCGTAAGGAACTCG；

192-1正向引物：ACGCGTATCCTCCCCTAAGT；

反向引物：AAGCGATATGGATTTGACGC；

所述菌種的帶型編號組合為：(1+2)(2+4+5)(3)(1)(2+3)(1+4)(1+4)(1+2+3+4)。

2.一種如權利要求1所述的香菇申香12號菌種的SSR標記指紋圖譜的構建方法，包括：

(1)將香菇菌種轉接到馬鈴薯葡萄糖液體培養基PDB中，23-25℃下避光搖瓶培養，3-4d后收集菌絲；

(2)用CTAB法提取上述菌絲的基因組DNA，檢測總基因組DNA濃度和純度，調整樣品DNA的濃度一致；

(3)對上述提取的DNA進行8對SSR標記的PCR擴增；

(4)將上述PCR擴增得到的產物與加樣緩沖液混勻，變性，點樣于變性聚丙烯酰胺凝膠上電泳，銀染，顯色，拍照，分析結果。

3.根據權利要求2所述的一種香菇申香12號菌種的SSR標記指紋圖譜的構建方法，其特征在于：所述步驟(2)中的CTAB法提取菌絲的基因組DNA具體工藝包括：

(1)將-20℃冷凍干燥的香菇菌絲研磨成粉末，加入65℃預熱的2×CTAB抽提液，于65℃保溫45-60min，輕搖混勻；

(2)12000rpm、4℃離心20min，取上清液；

(3)在上述上清液中加入體積比為25∶24∶1的酚、氯仿和異戊醇的混合液，混勻10min，12000rpm、4℃離心10min，取上清液移入離心管中；

(4)在上述離心管中加入體積比為24∶1的氯仿和異戊醇混合液，混勻10min，12000rpm、4℃離心10min，取上清液移入另一離心管中；

(5)在上述離心管中加入2/3體積的-20℃預冷的異丙醇，搖動5min，8000rpm、4℃離心10min，去上清；

(6)將得到的沉淀用75vol％乙醇和10mmol/L醋酸鉀洗滌2-3次，每次8000rpm，室溫離心5min；

(7)加入預冷的95vol％乙醇，上下顛倒，8000rpm室溫離心10min，棄乙醇，真空抽干或自然晾干；

(8)加入100μL 1×TE緩沖液，使沉淀溶解；

(9)加入1μL 10mg/mL的RNaseA于37℃水浴1h，去除RNA；

(10)將得到的DNA提取物于-20℃貯藏備用。

4.根據權利要求2所述的一種香菇申香12號菌種的SSR標記指紋圖譜的構建方法，其特征在于：所述步驟(3)中的PCR擴增體系為：總體積20μL，包括：10×PCR buffer 2μL，25mmol/L MgCl₂ 2μL，10mmol/L dNTP 0.4μL，5U/μL Taq DNA酶0.2μL，10μmol/L SSR標記正向引物和反向引物總體積各1.5μL，濃度20-30ng/μL提取的模板DNA 2μL，ddH₂O 10.4μL；

PCR反應條件：94℃5min；94℃30s，55℃30s，72℃30s，30個循環；72℃5min。