[發明專利]一種豬肝細胞無血清培養基及其制備方法

在審

• 申請號: 201710067361.1
• 申請日: 2017-02-07
• 公開（公告）號: CN107043738A
• 公開（公告）日: 2017-08-15
• 發明（設計）人: 唐勝球;江青艷;董小英;朱曉彤;賓艷芳;周桂炫;方心靈
• 申請（專利權）人: 韶關學院
• 主分類號: C12N5/071
• 分類號: C12N5/071
• 代理公司: 廣州駿思知識產權代理有限公司44425
• 代理人: 吳靜芝

技術領域

本發明涉及動物細胞培養技術領域，尤其涉及一種豬肝細胞無血清培養基及其制備方法。

背景技術

肝臟是人與動物機體發揮儲存糖原、調節代謝、去氧化、分泌活性因子和生物轉化等生理功能的重要器官，也是藥物代謝與解毒作用的主要場所。而肝細胞則是肝臟組織發揮上述生物學功能的主要執行者，為此眾多離體試驗常選用人或畜禽原代肝細胞為研究模型，展開肝細胞生理調節功能，代謝性疾病，藥理學、病理學和毒理學分子機制，建立病毒感染細胞模型，以及理化因子與毒物影響等領域的研究。原代肝細胞的離體培養是實施以上體外研究的首要環節，故成功實現肝細胞體外培養顯得至關重要。

目前，原代肝細胞的離體培養常采用血清培養基，借助外源血清提供細胞增殖分化所需的生長因子、激素、轉運蛋白及部分營養素等，以維持細胞正常的生長與分裂增殖，獲取其良好的生長狀態與分泌特性。但使用血清培養離體細胞，同時存在諸多不足，如血清成分復雜，所攜帶的未知物質及其可變因素，往往影響研究結果的準確性與重現性；血清存在種屬特性，異種應用容易引發不良的過敏反應與排斥性疾病等；血清還存在感染外源病毒和致病因子的巨大風險，容易導致感染轉移與交叉污染，不利于動物試驗或臨床研究結果的正確性。可見，尋找一種既能適合細胞正常生長，又能避免因添加外源血清干擾研究結果的豬用離體肝細胞培養基顯得尤為重要，以便實現豬肝細胞的無血清培養。據報道，美國、歐盟與日本等發達國家已于2010年全面停止血清在生物制藥中的應用，美國FDA也將停止受理以含血清細胞培養工藝生產的生物技術新藥及其相關醫療技術的申報，使得無血清細胞培養成為生命科學研究的新趨勢。

目前，國內外均無正式生產豬源性肝細胞無血清培養基的廠家。近年來，美國Invitrogen公司已推出HepatoZYME-SFM無血清培養基，但有文獻指出使用HepatoZYME-SFM無血清培養基進行原代大鼠肝細胞培養時，仍需加入了10％胎牛血清。此外，還有研究者采用其它無血清培養基進行相關研究，但是這幾種無血清培養基含有動物來源成分，且不能用于豬原代肝細胞懸浮培養，難以滿足科研和臨床應用的需求。其他商品化的肝細胞無血清培養基卻存在培養基的成分配方秘而不宣、價格昂貴與配制方法不確定等多方面問題，難以在肝細胞離體無血清培養研究領域推廣應用。國內雖有一些專利申請公開一些無血清肝細胞培養基，所開發的無血清肝細胞培養基均可適用于生物人工肝支持系統，但難以用于或適用于豬肝細胞無血清的培養，更無法滿足后者的相關研究和應用，故亟需研制一種新的豬肝細胞無血清培養基。

發明內容

基于此，本發明的目的在于克服現有技術中的缺點和不足，提供一種豬肝細胞無血清培養基及其制備方法，所述培養基能夠用于豬原代肝細胞的培養。

本發明是通過以下技術方案實現的：

一種豬肝細胞無血清培養基，其在基礎培養液中添加有如下組分：牛胰島素10.00mg/L，人轉鐵蛋白5.50mg/L，亞硒酸鈉5.02μg/L，乙醇胺2.00mg/L，地塞米松196.26μg/L，纖粘連蛋白0.5mg/L，維生素C 10.00mg/L，肝細胞生長因子60.00μg/L，表皮生長因子80.00μg/L，胰高血糖素2.00mg/L和牛血清白蛋白1.50g/L。

相對于現有技術，本發明的豬肝細胞無血清培養基，能夠用于豬原代肝細胞的培養，能夠促進培養的細胞貼壁，并保持良好的生長狀態，豬原代肝細胞經培養后形態、活力與含血清培養后的十分相當，且其生長狀況明顯良好，能很好地保持豬肝細胞原有的生物特性與生物學功能，還能避免因傳統含血清培養基所帶來的負面影響，能夠滿足肝細胞正常生長與分裂增殖的條件需求。

進一步，所述基礎培養液為Williams’Medium E基礎培養液，更優選為含有青霉素和鏈霉素的Williams’Medium E基礎培養液。該基礎培養液能夠有效抑制細菌生長，避免細胞被污染。

本發明所述的豬肝細胞無血清培養基的制備方法，包括以下步驟：

S1：于無菌環境中，按所述各組分的含量配制各組分的母液；

S2：將各組分的母液按比例加入基礎培養液中，充分混勻，即得到所述的豬肝細胞無血清培養。

相對于現有技術，本發明的豬肝細胞無血清培養基的制備方法，先配制各組分的母液，然后依次加入到基礎培養液中，能夠使各種添加組分充分混勻在基礎培養液中，使得到的無血清培養基均勻穩定，能夠促進培養的細胞貼壁，并保持良好的生長狀態。

進一步，步驟S1中，各組分的母液的配制方法如下：