[發明專利]一種5`端磷酸化單鏈DNA的制備方法及其應用

在審

• 申請號: 201710067173.9
• 申請日: 2017-02-06
• 公開（公告）號: CN108396043A
• 公開（公告）日: 2018-08-14
• 發明（設計）人: 樊春海;王麗華;李江;諸兵
• 申請（專利權）人: 中國科學院上海應用物理研究所
• 主分類號: C12P19/34
• 分類號: C12P19/34;C12N15/113;C12N5/10
• 代理公司: 上海弼興律師事務所 31283
• 代理人: 薛琦;朱水平

本發明公開了一種5'端磷酸化單鏈DNA的制備方法及其應用。該制備方法包括如下步驟：(1)在目的DNA兩端插入限制性內切酶的酶切位點序列，形成莖環結構前體；(2)將步驟(1)獲得的莖環結構前體溶解于緩沖液中并進行退火處理，獲得莖環結構溶液；(3)將步驟(2)獲得的莖環結構溶液加入限制性內切酶處理，處理后使限制性內切酶失活，得酶切產物；(4)將步驟(3)所得酶切產物回收，即得。本發明制備方法步驟簡單、成本低廉，磷酸化效率高，所得5'端磷酸化單鏈DNA易于表征和純化，將其應用于基因編輯、靶向定位和/或調控可以顯著提高效率，具有廣闊的應用前景。

技術領域

本發明屬于生物技術領域，具體地涉及一種5'端磷酸化單鏈DNA(5'P-ssDNA)的制備方法及其應用。

背景技術

近年來，以CRISPR(Clustered regularly interspaced short palindromicrepeats)技術為代表的新一代基因編輯技術由于其精準的靶向性和易用性，在生物學基礎研究和生物醫學應用中已經展現出不可估量的潛力。這類基因編輯系統通常利用了細菌中天然存在的防御機制，實現對入侵DNA的靶向剪切。除了CRISPR系統的Cas9系列限制性內切酶(也簡稱內切酶)之外，一些基于其他內切酶(例如Argonaute)的基因編輯系統也受到了廣泛的關注。該類內切酶采用5'磷酸化的單鏈DNA作為引導(guide DNA，gDNA)來幫助核酸酶識別目標基因序列并對其進行剪切。與CRISPR系統相比，這類系統采用短單鏈DNA而非RNA作為引導分子，無需構建用于RNA表達的質粒，更加易于人工合成和直接轉染。目前，商業化的單鏈DNA化學合成技術已經非常成熟且價格低廉，使得利用單鏈DNA(ssDNA)作為引導的基因編輯系統在成本上比利用RNA的CRISPR系統更有優勢。更重要的是，常規的CRISPR系統要求目標區域下游具有特定的PAM序列，而Argonaute系統無類似限制，幾乎可用于針對任何目標序列。

但是，與天然的DNA末端不同，默認條件合成的單鏈DNA 5'端沒有引入磷酸基團。為了獲得可用于基因編輯系統的引導DNA，我們需要對化學合成的單鏈DNA進行合成后的5'端磷酸化修飾。因此，磷酸化的效率就成為了影響基因編輯效率的關鍵因素之一。目前已有的某些研究表明，由商業化的引物合成服務提供的化學磷酸化修飾方法所獲得的5'-PssDNA在基因編輯應用當中對目標基因的剪切效率不佳，而用T4核酸激酶催化的磷酸化修飾也存在效率難以優化、修飾產物難以表征和純化的問題。

此外，基因工程中常用的經典DNA限制性內切酶催化的剪切反應通常識別并作用于DNA雙鏈，剪切產物也是雙鏈，因此不適合直接用于單鏈DNA的5'磷酸化。

發明內容

本發明要解決的技術問題是為克服現有技術中存在的磷酸化效率低、剪切效率不佳等困難提供一種5'端磷酸化單鏈DNA的制備方法及其應用。該制備方法具有操作簡便、磷酸化效率高、適用范圍廣以及應用前景廣闊等優點。

本發明解決上述問題的技術方案之一是：一種5'端磷酸化單鏈DNA的制備方法，其包括如下步驟：

(1)在目的DNA兩端插入限制性內切酶的酶切位點序列，形成莖環結構前體，其中所述目的DNA位于莖環結構前體的環狀單鏈區域，所述酶切位點序列位于莖環結構前體的莖部雙鏈區域；

(2)將步驟(1)獲得的莖環結構前體溶解于緩沖液中并進行退火處理，獲得莖環結構溶液；

(3)將步驟(2)獲得的莖環結構溶液加入限制性內切酶處理，處理后使限制性內切酶失活，得酶切產物；

(4)將步驟(3)所得酶切產物回收，即得。