[發明專利]一種5`端磷酸化單鏈DNA的制備方法及其應用

在審

• 申請號: 201710067173.9
• 申請日: 2017-02-06
• 公開（公告）號: CN108396043A
• 公開（公告）日: 2018-08-14
• 發明（設計）人: 樊春海;王麗華;李江;諸兵
• 申請（專利權）人: 中國科學院上海應用物理研究所
• 主分類號: C12P19/34
• 分類號: C12P19/34;C12N15/113;C12N5/10
• 代理公司: 上海弼興律師事務所 31283
• 代理人: 薛琦;朱水平

1.一種5'端磷酸化單鏈DNA的制備方法，其包括如下步驟：

(1)在目的DNA兩端插入限制性內切酶的酶切位點序列，形成莖環結構前體，其中所述目的DNA位于莖環結構前體的環狀單鏈區域，所述酶切位點序列位于莖環結構前體的莖部雙鏈區域；

(2)將步驟(1)獲得的莖環結構前體溶解于緩沖液中并進行退火處理，獲得莖環結構溶液；

(3)將步驟(2)獲得的莖環結構溶液加入限制性內切酶處理，處理后使限制性內切酶失活，得酶切產物；

(4)將步驟(3)所得酶切產物回收，即得。

2.如權利要求1所述的制備方法，其特征在于，所述酶切位點序列含有限制性內切酶的識別序列及酶切位點，所述的酶切位點能與識別序列分離；較佳地，所述限制性內切酶的酶切位點位于識別序列下游，即所述酶切位點序列與相鄰的目的DNA的堿基具有如下序列：

5’-S₁N₁N₂N₃-3’

3’-S₂N₄N₅N₆-5’；

所述S₁為限制性內切酶的識別序列的正向序列，所述S₂為限制性內切酶的識別序列的反向序列，所述N₁、N₂為目的DNA 3’末端兩個堿基的反向互補序列，N₃-N₆為目的DNA的堿基，所述酶切位點位于N₂和N₃之間以及S₂和N₄之間。

3.如權利要求2所述的制備方法，其特征在于，所述的酶切位點序列還含有保護堿基序列，其中S₁的5’端具有保護堿基序列1，S₂的3’端具有保護堿基序列2，保護堿基序列1與保護堿基序列2反向互補；較佳地，所述的保護堿基序列為含有3-6個堿基的GC含量高的序列；更佳地，所述的保護堿基序列1為：GCGC、GGGC或者CCCG。

4.如權利要求3所述的制備方法，其特征在于，步驟(1)所述的限制性內切酶為BseGI、BstF5I或BtsCI酶，所述的S₁序列為GGATG，S₂序列為CCTAC；

或者，所述的限制性內切酶為BtsαI或BtsI酶，所述的S₁序列為GCAGTG，S₂序列為CGTCAC；

或者，所述的限制性內切酶為BtsIMutI酶，所述的S₁序列為CAGTG，S₂序列為GTCAC；

或者，所述限制性內切酶為Bse3DI、BseMI或者BsrDI酶，所述的S₁序列為GCAATG，S₂序列為CGTTAC。

5.如權利要求4所述的制備方法，其特征在于，步驟(1)所述的限制性內切酶為BseGI，莖環結構前體序列為：5'-GCGCGGATG+N₁N₂+目的DNA+CATCCGCGC-3'；

和/或，步驟(2)所述的緩沖液包含下列組分：MgCl₂ 5mM，Tris-HCl 10mM，DNA 10μM；pH8.0。

6.如權利要求5所述的制備方法，其特征在于，步驟(2)所述的退火處理為：熱循環儀95℃處理5分鐘，然后迅速降溫至4℃，并保持10分鐘；

和/或，步驟(3)所述的限制性內切酶處理為33-38℃處理12小時以上，所述的限制性內切酶的酶活單位為8-15U；較佳地為37℃處理12小時，所述限制性內切酶的酶活單位為10U。

7.如權利要求5或6所述的制備方法，其特征在于，步驟(3)所述的使限制性內切酶失活為60-68℃處理莖環結構溶液15-25分鐘；較佳地為65℃處理莖環結構溶液20分鐘。