[發明專利]用于檢測腫瘤FFPE樣本中基因變異的試劑盒

在審

• 申請號: 201710067030.8
• 申請日: 2017-02-07
• 公開（公告）號: CN106755506A
• 公開（公告）日: 2017-05-31
• 發明（設計）人: 王旺;荊瑞琳;董永芳;玄兆伶;李大為;梁峻彬;陳重建
• 申請（專利權）人: 安諾優達基因科技（北京）有限公司
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12N15/11
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

技術領域

本發明屬于分子體外診斷領域，具體涉及特別適用于腫瘤FFPE樣本中基因變異的試劑盒。

背景技術

腫瘤組織多采用FFPE(formalin-fixed paraffin-embedded，福爾馬林固定石蠟包埋)樣品的形式進行保存。數量巨大的歸檔FFPE樣本為回顧性研究，闡明疾病機制，發現治療靶標和指示預后提供寶貴的資源。但FFPE樣本研究極具挑戰，首先石蠟包埋的醫療樣本十分珍貴，每個樣本總量都很有限且不可替代。其次FFPE樣本在制造的過程中，福爾馬林的固定會使組織中的核酸發生不同程度的降解和分子間的交聯，石蠟高溫深入過程進一步加速核酸的降解，保存的時間及環境對樣品中的核酸也有巨大影響。因此如何從有限的且容易發生核酸降解的FFPE樣本中成功檢測核酸的變異情況，是用于分子水平回顧性研究的關鍵。

有研究顯示，腫瘤的產生通常伴隨著核酸的變異。常見的變異類型有SNV(single nucleotide variant，單核苷酸變異)、CNV(Copy Number Variation，拷貝數變異)及FUSION(融合)等。

隨著新一代測序技術(next generation sequencing，NGS)的迅猛發展，大大的提高了測序速度，同時測序成本顯著降低。基于新一代測序技術平臺，臨床上應用最廣的方法為在同一個PCR反應體系中加入多對引物，能夠同時擴增多個DNA片段的多重PCR測序技術。

目前，很多公司推出了多重PCR方法富集腫瘤相關基因區域的試劑盒，如Qiagen公司的GeneRead DNAseq Colorectal Cancer Panel、Illumina公司的TruSight Tumor 15、Illumina公司的TruSeq Amplicon Cancer Panel等，但是 這些試劑盒只能檢測SNV，對于CNV和FUSION，該類產品均不能準確檢出，因此，多重PCR方法的適用性受到較大的限制。

發明內容

鑒于上述現有技術中存在的不足，本發明的目的在于提供一種用于檢測腫瘤FFPE樣本中基因變異的試劑盒，使用該試劑盒進行基因檢測，并通過高通量測序平臺進行測序，能夠同時穩定的檢出基因SNV、CNV以及FUSION。

本發明的發明人為解決上述問題進行了深入研究，結果發現：在腫瘤FFPE樣本基因變異的檢測方法中，通過使用基因捕獲的探針，即針對SNV區域設計的探針、針對CNV區域設計的探針、針對FUSION區域設計的探針，，公共引物如SEQ ID NO:1所示，標簽引物如SEQ ID NO:2～SEQ ID NO:5所示核苷酸序列。可以同時穩定的檢出基因SNV、CNV以及FUSION。

即本發明包括：

1.一種用于檢測腫瘤FFPE樣本中基因變異的試劑盒，其包括用于基因捕獲的探針，所述基因捕獲的探針包括：針對SNV區域設計的探針、針對CNV區域設計的探針、針對FUSION區域設計的探針，公共引物如SEQ ID NO:1所示，以及標簽引物如SEQ ID NO:2～SEQ ID NO:5所示核苷酸序列。

2.根據項1所述的試劑盒，其中，所述腫瘤為胃癌、肺癌、乳腺癌、結直腸癌、肝癌及卵巢癌中的一種或兩種以上。

3.根據項1所述的試劑盒，其中，所述基因捕獲的探針是生物素化的。

4.根據項1～3中任一項所述的試劑盒，其中，所述基因捕獲試劑盒還包括鏈霉親和素標記的磁珠。

5.根據項1所述的試劑盒，其中，所述試劑盒還包括用于提供雜交捕獲反應的離子環境的緩沖液。

6.根據項1所述的試劑盒，其中，所述試劑盒還包括用于洗脫物理吸附或非特異性雜交的清洗液。

7.根據項1所述的試劑盒，其中，所述試劑盒用于在腫瘤相關基因的基因捕獲測序中進行基因捕獲；優選地，所述基因捕獲測序用于檢測腫瘤相關基因的SNV、CNV、以及FUSION。

8.一種腫瘤FFPE樣本中基因變異的檢測方法，其中，使用項1～7中任一項所述試劑盒進行基因檢測。

9.一種用于檢測腫瘤FFPE樣本中基因變異的二代測序DNA文庫的構建方法，其中，包括對構建的文庫進行基因捕獲的步驟，其中所述基因捕獲使用項1～7中任一項所述的試劑盒進行。

10.一種捕獲探針，其中，所述基因捕獲的探針包括針對SNV區域設計的探針、針對CNV區域設計的探針、和/或針對FUSION區域設計的探針。

有益效果：相對于現有方法，本發明的試劑盒能夠同時檢測更多的區域，同時檢測出基因SNV、CNV及FUSION。