[發(fā)明專利]牛冷凍精液稀釋液制備方法

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• 申請?zhí)枺?/td>: 201710065529.5
• 申請日: 2017-02-06
• 公開（公告）號: CN106818709A
• 公開（公告）日: 2017-06-13
• 發(fā)明（設計）人: 潘越博;黃龍艷;黃龍梅;張登輝;盧旺銀;賀軍;王璽年;劉輝
• 申請（專利權）人: 潘越博
• 主分類號: A01N1/02
• 分類號: A01N1/02
• 代理公司: 北京科億知識產權代理事務所(普通合伙)11350
• 代理人: 湯東鳳

1.一種牛冷凍精液稀釋液制備方法，其特征在于，按照以下步驟進行：

步驟1：精液稀釋液配置；

按比例，稱取果糖5～8g、檸檬酸鈉19.8～26.6 g，無損耗地移入1000 mL的燒杯內，加入蒸餾水800 mL，用消毒過的玻璃棒或磁力攪拌器攪拌，使果糖和檸檬酸鈉充分溶解，然后將溶液用濾紙過濾于三角燒瓶或鹽水瓶中，扎好或塞緊瓶口，置75～80℃水浴鍋中消毒30 min，冷卻至常溫后再加入180～220 mL的新鮮卵黃，以及再加入青霉素、鏈霉素各40～50萬IU單位，按此比例配置的溶液稱為第一液；

取第一液430 mL加入65～75 mL甘油，并用磁力攪拌器充分攪拌均勻后放入3～5℃的冰箱或生化培養(yǎng)箱內待用，按此比例配置的溶液稱之為第二液；

步驟2：精液稀釋；

用35℃的第一液緩慢地加入原合格精液中，輕輕搖勻，用燒杯盛適量的35℃水，把稀釋管放入后送0～5℃低溫柜內降溫，與此同時把第二液也放入；平衡2 h后水杯中加冰塊促使其快速降溫，當降溫至10℃時加入第二液，加入第二液后再平衡30 min以上，才能在低溫柜中進行細管分裝，分裝后的細管即可進行冷凍；

步驟3：精液冷凍；

將平衡、封裝后的細管精液按棉塞封口端靠近操作者的方向上架碼放，碼放在平衡架上，超聲波封口端遠離操作者，細管放入冷凍儀時也應如此放置；每個平衡架上放一根細管的標記物，為了便于識別，一頭種公牛用同一顏色的標記物；如果同一個平衡架上有不同種公牛的細管精液，須分開碼放，且要隔開一些距離，以免混淆；

在細管凍精生產過程中，使用由計算機控制的全自動冷凍儀，首先在電腦中設置好最佳冷凍溫度曲線，冷凍儀與低溫柜應盡量靠近，開啟液氮罐閥門把冷凍儀降溫至4℃，關閉風扇電源，待風扇完全停止后把已排滿待凍細管的平衡架迅速輕放人冷凍儀，蓋好蓋子，按預先設定的程序自動完成冷凍過程；

步驟4：凍精解凍與抽檢；

預先把水浴箱水溫加熱至38～40℃，用鑷子夾取一支冷凍后的細管凍精迅速浸入38～40℃水中并輕輕晃動，待溶解后立即取出，用吸水紙或紗布擦干水珠，再用細管專用剪剪去超聲波封口端，滴一小滴精液于經過預熱的載玻片上即可進行鏡檢，評價精子活率；

步驟5：凍精包裝；

在-140℃以下的環(huán)境中，用細管計數(shù)分裝機進行包裝，包裝后的細管其棉塞端在塑料管的底部，不得倒置，塑料包裝管的內徑應均勻一致，不得用上口大、底部小的塑料管，包裝好的細管凍精人庫貯存。

2.根據(jù)權利要求1所述的牛冷凍精液稀釋液制備方法，其特征在于，所述步驟2中，細管分裝使用細管灌封一體機進行。

3.根據(jù)權利要求1所述的牛冷凍精液稀釋液制備方法，其特征在于，還包括步驟6，凍精貯存；凍精貯存在液氮罐的液氮中，每周定時加一次液氮，當發(fā)現(xiàn)液氮罐外殼出現(xiàn)白霜時，應立即將精液轉移人其他液氮罐內保存；包裝好的凍精液氮罐間轉換時，在液氮罐外停留時間不能超過3s；取存凍精后要蓋好液氮罐塞，在取放蓋塞時，要垂直輕拿輕放，不得用力過猛，防止液氮罐塞折斷或損壞；移動液氮罐時，應提握液氮罐手柄抬起罐體后再移動，不得在地上拖行。

4.根據(jù)權利要求1所述的牛冷凍精液稀釋液制備方法，其特征在于，還包括步驟7：凍精運輸；凍精運輸過程不得橫倒、碰撞和強烈振動，保證凍精始終浸在液氮中。

5.根據(jù)權利要求1所述的牛冷凍精液稀釋液制備方法，其特征在于，所述步驟2中，所加第一液的量=[（稀釋液總量+合格精液量）／2] -合格精液量；

稀釋液總量=原精液量×（稀釋倍數(shù)-1）；

稀釋倍數(shù)=(原精液精子密度×原精液精子活力×冷凍后精子活力)/每頭份輸精量所含有效精子數(shù)/ 0.25；

所加第二液的量=（所加稀釋液總量一所加第一液的量）。