[發明專利]一種快速檢測紡織品中銅綠假單胞菌的方法

有效

• 申請號: 201710065472.9
• 申請日: 2017-02-06
• 公開（公告）號: CN106591483B
• 公開（公告）日: 2020-06-23
• 發明（設計）人: 李軻;郭會清;郭華麟;張淑霞;徐超;喬晴;禹建鷹;張超峰
• 申請（專利權）人: 鄭州海關技術中心
• 主分類號: C12Q1/6844
• 分類號: C12Q1/6844;C12Q1/689;C12Q1/04;G01N33/68;C12R1/385
• 代理公司: 鄭州博派知識產權代理事務所(特殊普通合伙) 41137
• 代理人: 榮永輝

本發明公開了一種快速檢測紡織品中銅綠假單胞菌的方法，以銅綠假單胞菌特有的ETA保守序列為靶基因序列，設計一套LAMP特異性引物，對紡織品樣品增菌后產物進行LAMP擴增，擴增后的產物形成白色沉淀，通過對比觀察可判定結果，或通過濁度儀觀察結果，樣品反應濁度值小于0.1時，可判定該樣品結果為陰性，樣品反應濁度值大于或等于0.1時，可判定該樣品結果為陽性。對判定為陽性樣品增菌液接種平板分離，挑取平板上典型或可疑菌落，利用MALDI?TOF?MS技術鑒定快速鑒定出結果。本方法操作簡單，快速、高效、特異性強，靈敏度高，結果觀察方便、直觀。

技術領域

本發明涉及一種銅綠假單胞菌的檢測方法，具體涉及一種快速檢測紡織品中銅綠假單胞菌的方法。

背景技術

銅綠假單胞菌(P.Aeruginosa)原稱綠膿桿菌，是一種高致死率、溶血性、抗藥性強的革蘭氏陰性桿菌，在分類上屬假單胞菌科中的假單胞菌屬，此菌屬種類多達200種以上，在自然界分布廣泛，是土壤中存在的最常見的細菌之一。本菌最主要的生長條件是潮濕環境，其它條件要求不高。紡織品極易吸潮，具備銅綠假單胞菌生長的所有因素，能夠提供其繁殖的理想環境，包括合適的pH，溫度及水營養，也能提供其繁殖所需的大表面積。因此紡織品中一旦污染銅綠假單胞菌，該菌會頑強地吸附在纖維上，一般的清洗、曝曬是消滅不了的。

銅綠假單胞菌可暫時寄生于皮膚，因此接觸性體表感染率相當高，能引起人中耳炎、角膜炎、尿道炎和下呼吸道感染，亦可引起心內膜炎、胃腸炎、膿胸，甚至通過血流導致敗血癥，可引起病人死亡。

銅綠假單胞菌檢測有多種方法，常見的主要有傳統標準方法、全自動微生物分析系統分析法、分子生物學方法(常規PCR法、多重PCR法、PCR-DHPLC法、Real-time PCR法、基因芯片技術)、免疫學方法(免疫磁性分離法、熒光激活細胞分離法、酶聯免疫吸附法)、蛋白多肽檢測方法等。傳統檢測方法程序繁瑣、周期長、靈敏度低。免疫學方法制備抗體較困難、不能同時檢測多種成分，對實驗人員技巧性要求高，易出現交叉污染。分子生物學方法具有高靈敏度、準確、快速等優點，但需要專門儀器設備，易污染，對檢驗人員要求較高。目前紡織品領域銅綠假單胞菌的檢測都采用的傳統培養法定性檢測，在方法檢測程序上也都大致相同，增菌→分離→鏡檢和其它驗證試驗，需要4d～6d。

銅綠假單胞菌是條件致病菌，在環境中廣泛存在多種變體。銅綠假單胞菌可產生許多致病因子或毒力因子，包括彈性酶、堿性蛋白酶、LasA蛋白酶、溶血素、綠膿素，綠膿素是銅綠假單胞菌分泌的重要毒力因子之一。銅綠假單胞菌附著生長狀態產綠膿素遠遠高于浮游生長狀態下產綠膿素量，常常浮游生長狀態下綠膿素產生不明顯，因此對樣品一次增菌后，僅憑是否產生綠膿素來判定銅綠假單胞菌是否生長不夠嚴謹，不能快速得出結果，對一次增菌液進行DNA提取，初步篩選更科學合理些。

發明內容

針對現有技術的不足，本發明提供了一種快速檢測紡織品中銅綠假單胞菌的方法，達到 了高效、準確、省時省力的效果。具體技術方案如下：

一種快速檢測紡織品中銅綠假單胞菌的方法，包括以下步驟：

步驟一：樣品增菌

用無菌的方式取樣、增菌培養，得增菌液；

步驟二：LAMP試驗

2.1)DNA模板的制備：取增菌液放入滅菌Eppendorf管內，高速冷凍離心機離心處理，除去雜質，獲得DNA模板；

2.2)LAMP擴增反應

2.2.1)擴增準備：根據樣本數量設定所需要的LAMP反應管數n(n＝1管空白對照+1管陰性對照+1管陽性對照+樣本數)，取出n個LAMP反應管。擴增反應體系見表1，按表1計算好各試劑的使用量，按表1的順序加入滅菌離心管中，混合混勻，2000r/min離心10sec，向設定的n個LAMP反應管中分別加入23μL；

表1 反應體系