[發明專利]一種快速檢測紡織品中銅綠假單胞菌的方法

有效

• 申請號: 201710065472.9
• 申請日: 2017-02-06
• 公開（公告）號: CN106591483B
• 公開（公告）日: 2020-06-23
• 發明（設計）人: 李軻;郭會清;郭華麟;張淑霞;徐超;喬晴;禹建鷹;張超峰
• 申請（專利權）人: 鄭州海關技術中心
• 主分類號: C12Q1/6844
• 分類號: C12Q1/6844;C12Q1/689;C12Q1/04;G01N33/68;C12R1/385
• 代理公司: 鄭州博派知識產權代理事務所(特殊普通合伙) 41137
• 代理人: 榮永輝

1.一種快速檢測紡織品中銅綠假單胞菌的方法，包括以下步驟：

步驟一：樣品增菌

用無菌的方式取樣、增菌培養，得增菌液；

步驟二：LAMP試驗

2.1)DNA模板的制備：取增菌液放入滅菌Eppendorf管內，高速冷凍離心機離心處理，除去雜質，獲得DNA模板；

2.2)LAMP擴增反應

2.2.1)擴增準備：根據樣本數量設定所需要的LAMP反應管數n(n＝1管空白對照+1管陰性對照+1管陽性對照+樣本數)，取出n個LAMP反應管；擴增反應體系見表1，按表1計算好各試劑的使用量，按表1的順序加入滅菌離心管中，混勻，2000r/min離心10sec，向設定的n個LAMP反應管中分別加入23μL；

表1反應體系

2.2.2)設定空白對照、陰性對照、陽性對照

每次反應均設置陰性對照、空白對照和陽性對照；

空白對照：以水代替DNA模板；

陰性對照：以水代替樣品，按步驟2.1)提取模板DNA作為LAMP反應的模板；

陽性對照：銅綠假單胞菌標準菌株增菌后按2.1)提取模板DNA作為LAMP反應的模板；

2.2.3)加樣

將步驟2.1)制備好的DNA模板、步驟2.2.2)中的空白對照、陰性對照、陽性對照各取2μL加入相應的反應管中，使反應體系達到25μL；蓋緊管蓋，混勻，2000r/min離心10sec；

2.2.4)上機反應

將步驟2.2.3)離心后的反應管置于水浴鍋或LAMP實時濁度儀中，63℃擴增40min；

2.2.5)初步觀察結果

2.2.5.1)可視化觀察結果

反應結束后取出反應管，將反應管置于黑色背景下觀察；先觀察對照反應管，有白色沉淀者為陽性，無白色沉淀者為陰性；如果結果為陰性，可直接報告樣品中未檢出銅綠假單胞菌，如結果為陽性或可疑，繼續進行步驟三的鑒定；

2.2.5.2)濁度儀結果

反應結束后，觀察LAMP實時濁度儀生成的擴增曲線，空白對照、陰性對照無擴增曲線，反應濁度值小于0.1，陽性對照有典型擴增曲線且反應濁度值大于0.1，否則實驗視為無效；樣品反應濁度值小于0.1時，可判定該樣品結果為陰性；樣品反應濁度值大于或等于0.1時，可判定該樣品結果為陽性；

步驟三：MALDI-TOF-MS技術鑒定

3.1)分離

取步驟2.2.5)初步觀察結果為陽性的樣品的增菌培養液，用一次性接種環，從培養液的薄菌膜下方挑取培養物，劃線接種在一個假單胞菌CN選擇性培養基平板上，置36℃±1℃培養24h±2h；銅綠假單胞菌在此培養基上，其菌落扁平無定型，向周邊擴散或略有蔓延，表面濕潤，菌落呈灰白色，菌落周圍培養基常擴散有水溶性色素；挑取2個或2個以上假單胞菌CN選擇性培養基平板上典型或可疑菌落，通過MALDI-TOF-MS技術鑒定可疑菌落指紋譜圖，利用MALDI Biotyper System分析對比得出最終鑒定結果；

3.2)MALDI-TOF-MS技術鑒定確認

3.2.1)配制標準品和基質

配置標準品和基質的標準溶劑為50％乙腈+47.5％水+2.5％三氟乙酸；

標準品配制：取出MALDI Biotyper System專用的標準品(Bacterial Test Standard，BTS)，加入標準溶劑50μL；使用移液器反復吹吸的方式，溶解BTS粉末；室溫放置5min之后重復吹吸，13000r/min離心2min，備用；

基質配制：取出MALDI Biotyper System專用的基質HCCAportioned，加入250μL標準溶劑，振蕩混勻，直到形成澄清溶液；

3.2.2)MALDI BioTyper自動鑒定

挑取假單胞菌CN選擇性培養基平板上單個菌落均勻涂抹于靶板靶孔內，加1μLHCCA基質溶液覆蓋上述樣品點，室溫下晾干；將靶板放入MALDI BioTyper自動鑒定儀，MALDIBiotyper System分析過程中同時采集樣品質譜圖，由FlexControl3.0得到蛋白峰信息，自動鑒定結果；

步驟四：結果報告

根據步驟二試驗，初步判定樣品中銅綠假單胞菌檢測結果；初步結果為陰性，可直接報告樣品中未檢出銅綠假單胞菌，如初步結果為陽性或可疑，按步驟三進行確認，報告樣品中檢出或未檢出銅綠假單胞菌；

其中，步驟2.2.1)擴增準備中所述的引物的核苷酸序列為：

外引物F3：5'-TCTTCGGGCAGCTCCG-3'

外引物B3：5'-TGGAGGTTGGCCGAACTC-3'

內引物FIP：5'-GCACATCCCGTGGTGCGTG-CAGCGGCGTGGGAGTT-3'

內引物BIP：5'-TGGAACGGGGTGGCTTGG-ATAGCGCCCCGAAACCG-3'

環引物LoopF：5'-CAAGTGCCCGTATTGCGAC-3'

環引物LoopB：5'-ACGGCGGGGCGGGGTGGAG-3'。