[發(fā)明專利]一種桑樹病原菌高通量鑒定及種屬分類方法及其應用

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201710064067.5
• 申請日: 2017-01-24
• 公開（公告）號: CN106868116B
• 公開（公告）日: 2020-12-11
• 發(fā)明（設計）人: 劉吉平;劉希;陳杰湖
• 申請（專利權）人: 華南農業(yè)大學
• 主分類號: C12Q1/6895
• 分類號: C12Q1/6895;G16B30/00;G16B40/00
• 代理公司: 廣州粵高專利商標代理有限公司 44102
• 代理人: 任重

1.一種桑樹病原菌高通量鑒定及種屬分類方法，其特征在于，所述方法包括以下步驟：

S1.收集桑樹病葉或感病部位的器官；

S2.提取桑樹病葉或感病部位的器官的總DNA；

S3. Illumina DNA文庫構建；

S4. Illumina高通量測序；

S5.去除測序數據中桑樹基因組序列；

S6.組裝微生物基因組序列；

S7.組裝完整核糖體DNA序列；

S8.篩選標記微生物核糖體DNA序列；

S9.對比分析核糖體DNA序列進行種屬分類；

步驟S3所述Illumina DNA文庫構建的方法為：依照Illumina文庫構建流程，將所述步驟S2中所述總DNA構建為片段大小400～600bp的雙末端高通量測序文庫；

其中，步驟S5所述去除測序數據中桑樹基因組序列的方法為：

利用比對軟件對步驟S4中所述高通量測序的數據進行數據比對分析；選擇比對算法，將測序數據與桑樹參考基因組進行比對，并將比對上參考基因組的所述測序數據判定為桑樹基因組序列；使用編寫的計算機程序從所述測序數據中去除桑樹基因組序列；

S5所述去除桑樹的基因組DNA序列選用的參考基因組序列為：

桑屬川桑Morusnotabilis全基因組序列GCA_000414095.2和葉綠體基因組序列NC_027110.1；

所述比對軟件為bwa0.7.12-r1039軟件；

所述比對算法為mem比對算法；

所述將測序數據與桑樹參考基因組進行比對采用雙末端比對方法和bwa0.7.12-r1039軟件的默認參數；

所述編寫的計算機程序用python計算機語言編寫。

2.根據權利要求1所述桑樹病原菌高通量鑒定及種屬分類方法，其特征在于，步驟S6所述組裝微生物基因組序列的方法為：使用組裝軟件對步驟S5所述已去除桑樹基因組序列的測序數據進行組裝；

所述組裝軟件為MetaVelvetv1.2.01。

3.根據權利要求1所述桑樹病原菌高通量鑒定及種屬分類方法，其特征在于，步驟S7所述組裝完整核糖體DNA序列的方法為：采用比對軟件，對所述組裝序列進行比對，根據比對結果從測序數據中獲取雙末端測序片段，使用組裝軟件對序列進行組裝和延伸，經多個循環(huán)操作，直至獲得完整的核糖體DNA序列；

所述比對軟件為bwa0.7.12-r1039軟件；

所述比對方法采用無錯配0 mismatch和無斷裂0 gap比對；

所述組裝軟件為MetaVelvetv1.2.01軟件。

4.根據權利要求1所述桑樹病原菌高通量鑒定及種屬分類方法，其特征在于，步驟S8所述篩選標記微生物核糖體DNA序列的方法為：使用序列比對分析軟件，設定比對期望值，將步驟S6所述微生物基因組序列與數據庫進行比對，根據比對結果對序列標簽進行注釋及物種分析；

所述比對期望值1e-20；

所述序列比對分析軟件為blastn2.2.31+軟件；

所述數據庫NCBI數據庫中的nt數據庫。

5.根據權利要求1所述桑樹病原菌高通量鑒定及種屬分類方法，其特征在于，步驟S9所述對比分析核糖體DNA序列進行種屬分類的方法為：使用軟件1對所述微生物核糖體DNA序列進行統(tǒng)計分析，選取系統(tǒng)樹構建模型，將所述模型代入軟件2中，構建系統(tǒng)進化樹；

所述軟件1為jModelTest2在線軟件；

所述系統(tǒng)樹構建模型為AIC值最小的替代模型GTR+G；

所述軟件2為RaxML8.1.5；

所述構建系統(tǒng)進化樹的方法使用最大似然法構建的系統(tǒng)進化樹，進化樹迭代次數為1000次。

6.權利要求1～5任一項所述桑樹病原菌高通量鑒定及種屬分類方法在桑樹病原菌定量分析方面的應用。

7.根據權利要求6所述的應用，其特征在于，應用于檢測桑葉黑斑病和/或桑葉白粉病。