[發明專利]一種桑樹病原菌高通量鑒定及種屬分類方法及其應用

有效

• 申請號: 201710064067.5
• 申請日: 2017-01-24
• 公開（公告）號: CN106868116B
• 公開（公告）日: 2020-12-11
• 發明（設計）人: 劉吉平;劉希;陳杰湖
• 申請（專利權）人: 華南農業大學
• 主分類號: C12Q1/6895
• 分類號: C12Q1/6895;G16B30/00;G16B40/00
• 代理公司: 廣州粵高專利商標代理有限公司 44102
• 代理人: 任重

本發明公開了一種桑樹病原菌高通量鑒定及種屬分類的方法。本發明通過收集桑樹病葉或感病部位的器官；提取桑樹病葉或感病部位的器官的總DNA；Illumina DNA文庫構建；Illumina高通量測序；去除測序數據中桑樹基因組序列；組裝微生物基因組序列；組裝完整核糖體DNA序列；篩選標記微生物核糖體DNA序列；對比分析核糖體DNA序列進行種屬分類實現對桑樹病原菌的鑒定及種屬分類。結果顯示，運用本發明方法對桑樹黑斑病病原菌進行鑒定及種屬分類，共鑒定出16種真菌，其中相對豐度最高的為Pseudocercospor屬病原菌，由此推定桑樹黑斑病病原菌的病原菌為Pseudocercospora，并命名為Pseudocercospora mori；該屬絕大部分為植物病原，大部分導致植物出現褐斑，與本發明葉片病征相符合。

技術領域

本發明涉及病原菌鑒定及種屬分類技術領域，更具體地，涉及一種桑樹病原菌高通量鑒定及種屬分類的方法及應用。

背景技術

桑樹我國重要經濟作物，具有藥用價值，關于桑樹的病害這方面的研究較少，一方面是桑樹的病害并不是常年大面積的發生，影響生產，而桑樹的經濟價值也沒有高到小范圍的發病會造成生產損失，發病通常會直接選擇剪枝；另一方面則是了解某些病的病征有哪些，怎么防治解決，卻不大關注病原的研究。這也是在真菌的系統分類變動巨大的時候，桑樹病原真菌的信息卻沒有多少更新的原因。

以桑污葉病為例，桑污葉病為夏秋季寄生在桑葉上的常見病害之一，常與桑黑斑病相混淆，多發于成熟老化的葉片上，嫩葉上少有。硬化早的桑葉、通風透光差、離地面較近的葉片易發病。發病時病葉背面蒙上一層黑色煙煤狀物，在對應的葉表面也產生同樣大小的灰黃色至暗褐色變色斑。嚴重時病斑融合或布滿葉背，造成整張葉片變色。該病使葉質變劣，提早硬化，容易萎凋，不適于飼養蠶(王向東，2009)。該病的傳播主要以菌絲在病葉組織內越冬，次年夏秋兩季，越冬菌絲上產生分生孢子，借風雨傳播，引起初侵染，后在新病斑上又產生分生孢子進行再侵染(張月季，1975)。該病多發生在晚秋落葉前，常與桑葉白粉病同時發生。

傳統分類上桑污葉病(mulberry leaf mold)的病原菌原為桑旋孢霉(Clasterosporium mori Sydow)，屬半知菌亞門(Deuteromycotina)，絲孢綱(Hyphomycetes)，絲孢目(Hyphomycetales)，暗梗孢科(/暗色孢科)(Dematiaceae)，穿孢霉屬(/穿孔霉屬/刀孢)(Clasterosporium)(1985)；而關于桑污葉病菌屬(Clasterosporium)在最近出版的《DictionaryoftheFungi》(第十版)(Kirk,etal.,2008)中，被劃歸為真菌界(Fungi)，子囊菌門(Ascomycota)，糞殼菌綱(Sordariomycetes)，糞殼菌亞綱(Sordariomycetidae)，巨座殼目(Magnaporthales)，巨座殼科(Magnaporthaceae)。桑污葉病菌屬(Clasterosporium)的系統分類從門(phylum)到科(family)全部改變。

現有研究方法中，利用傳統形態學分類方法對植物病原菌的鑒定方法中，植物病原菌的分離純化需根據病原菌的特性進行操作。植物病原菌分專性寄生和非專性寄生兩種。專性寄生菌為只能在特定宿主上生長繁殖，不能在人工培養基上培養，如白粉病菌(Agrios，2004,Plants Pathology(5_thedition))，非專性寄生則沒有限制。對未知的植物病原菌進行分離，方法有兩種。一種是刮取病斑上的菌絲孢子，接種至PDA培養基上，將生長的菌落不斷純化至獲得純培養菌株；另一種方法則是將葉片表面消毒后，將葉片置于合適的環境，葉片內生的菌絲會形成分生孢子梗繼續生長至在葉片上重新形成病斑。傳統的鑒定方法往往耗時較長，且在可能在分離純化的過程中，丟失部分病原菌種。