[發(fā)明專利]一種基于DNA-銀納米簇分子信標與核酸外切酶III循環(huán)信號放大的轉(zhuǎn)錄因子檢測方法

有效

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• 申請日: 2017-01-25
• 公開（公告）號: CN106970229B
• 公開（公告）日: 2018-11-16
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 周學敏;李昺之;徐磊;陳月;朱婉瑩;沈心;洪俊麗
• 申請（專利權(quán)）人: 南京醫(yī)科大學
• 主分類號: G01N33/68
• 分類號: G01N33/68
• 代理公司: 北京思創(chuàng)大成知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司 11614
• 代理人: 尹慧晶

本發(fā)明公開了一種基于DNA?銀納米簇分子信標與核酸外切酶III循環(huán)信號放大的轉(zhuǎn)錄因子檢測方法，首次將DNA?銀納米簇分子信標這種新型納米材料作為熒光探針應(yīng)用于轉(zhuǎn)錄因子的檢測。并且，基于DNA?銀納米簇分子信標的熒光調(diào)節(jié)是由可以被酶切割的DNA片段這一特征，加入了核酸外切酶III，既參與了信號的轉(zhuǎn)化，又參與了檢測信號的增強。本發(fā)明中轉(zhuǎn)錄因子的檢測方法具有免標記，選擇性高，低成本，靈敏度高的優(yōu)點，能夠?qū)崿F(xiàn)生物樣品中轉(zhuǎn)錄因子的高通量檢測。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于分析檢測技術(shù)領(lǐng)域，具體涉以基于DNA-銀納米簇分子信標與核酸外切酶 III循環(huán)放大的轉(zhuǎn)錄因子檢測方法。

背景技術(shù)

轉(zhuǎn)錄因子(Transcription factors,TFs)是細胞中的一種調(diào)控蛋白，通過與基因中的DNA順式作用元件結(jié)合，來啟動和調(diào)節(jié)基因的轉(zhuǎn)錄過程。研究認為，轉(zhuǎn)錄因子決定了被調(diào)控基因的開啟、關(guān)閉以及表達量，因此在基因表達中起著至關(guān)重要的作用。與此同時，也有大量研究指出，轉(zhuǎn)錄因子的非正常表達與活化，廣泛的存在于人體的病理過程中，這些病理過程包括癌癥的產(chǎn)生于轉(zhuǎn)移、病毒感染、自身免疫疾病等，因此，轉(zhuǎn)錄因子既可以作為一種潛在的診斷標志物，又可以成為臨床治療的靶點。同時轉(zhuǎn)錄因子的表達水平也是基礎(chǔ)生物醫(yī)學研究中的一項重要參數(shù)。

綜上所述，實現(xiàn)免標記，快速、靈敏、高通量檢測轉(zhuǎn)錄因子是現(xiàn)在研究的熱點之一。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的在于提供一種已DNA-銀納米簇分子信標(DNA-Ag nanoclustersmolecular beacons，AgMBs)為熒光探針，并且由核酸外切酶III(Exonuclease III， ExoIII)輔助循環(huán)信號放大的轉(zhuǎn)錄因子檢測新方法，從而達到快速、靈敏并且高選擇性的目的，克服現(xiàn)有轉(zhuǎn)錄因子檢測方法靈敏度低，檢測耗時，成本過高以及步驟繁瑣的缺點。

一種基于DNA-銀納米簇分子信標與核酸外切酶III循環(huán)信號放大的轉(zhuǎn)錄因子檢測方法，其包括如下步驟：

a)將單鏈DNA reporter與其互補單鏈s-reporter在Tris-Ac緩沖液中雜交形成雙鏈探針 dsNF-κB p50 probe；

b)將不同濃度的轉(zhuǎn)錄因子與dsNF-κB p50 probe孵育，再加入Exo III進行酶切，酶切后加入AgMBs，孵育反應(yīng)；

c)熒光檢測：測定樣品在561nm激發(fā)波長下，620nm處的熒光值。利用測得的I₆₂₀的值，獲得轉(zhuǎn)錄因子濃度與熒光強度的線性關(guān)系。

d)從實際細胞或組織樣品中獲得核蛋白提取物作為待測樣品，根據(jù)所得到的線性關(guān)系與待測樣品獲得的熒光強度，得到待測樣品中轉(zhuǎn)錄因子的濃度。

在步驟a)之前，配置Tris-Ac緩沖液，具體配方是10mM Tris-Ac,0.1mM EDTA,100mM NaAc。市售購買本發(fā)明所需要的所有DNA寡核苷酸。具體見表1：

表1本發(fā)明中使用的DNA序列

步驟a)具體為：用Tris-Ac緩沖液溶解凍干的寡核苷酸，得到100μM的reporter與s-reporter，隨后將二者等體積渦旋，加熱至95℃，維持10min后緩慢降溫至室溫，降溫過程維持至少一小時。