[發明專利]一種基于DNA-銀納米簇分子信標與核酸外切酶III循環信號放大的轉錄因子檢測方法

有效

• 申請號: 201710062737.X
• 申請日: 2017-01-25
• 公開（公告）號: CN106970229B
• 公開（公告）日: 2018-11-16
• 發明（設計）人: 周學敏;李昺之;徐磊;陳月;朱婉瑩;沈心;洪俊麗
• 申請（專利權）人: 南京醫科大學
• 主分類號: G01N33/68
• 分類號: G01N33/68
• 代理公司: 北京思創大成知識產權代理有限公司 11614
• 代理人: 尹慧晶

本發明公開了一種基于DNA?銀納米簇分子信標與核酸外切酶III循環信號放大的轉錄因子檢測方法，首次將DNA?銀納米簇分子信標這種新型納米材料作為熒光探針應用于轉錄因子的檢測。并且，基于DNA?銀納米簇分子信標的熒光調節是由可以被酶切割的DNA片段這一特征，加入了核酸外切酶III，既參與了信號的轉化，又參與了檢測信號的增強。本發明中轉錄因子的檢測方法具有免標記，選擇性高，低成本，靈敏度高的優點，能夠實現生物樣品中轉錄因子的高通量檢測。

技術領域

本發明屬于分析檢測技術領域，具體涉以基于DNA-銀納米簇分子信標與核酸外切酶 III循環放大的轉錄因子檢測方法。

背景技術

轉錄因子(Transcription factors,TFs)是細胞中的一種調控蛋白，通過與基因中的DNA順式作用元件結合，來啟動和調節基因的轉錄過程。研究認為，轉錄因子決定了被調控基因的開啟、關閉以及表達量，因此在基因表達中起著至關重要的作用。與此同時，也有大量研究指出，轉錄因子的非正常表達與活化，廣泛的存在于人體的病理過程中，這些病理過程包括癌癥的產生于轉移、病毒感染、自身免疫疾病等，因此，轉錄因子既可以作為一種潛在的診斷標志物，又可以成為臨床治療的靶點。同時轉錄因子的表達水平也是基礎生物醫學研究中的一項重要參數。

綜上所述，實現免標記，快速、靈敏、高通量檢測轉錄因子是現在研究的熱點之一。

發明內容

本發明的目的在于提供一種已DNA-銀納米簇分子信標(DNA-Ag nanoclustersmolecular beacons，AgMBs)為熒光探針，并且由核酸外切酶III(Exonuclease III， ExoIII)輔助循環信號放大的轉錄因子檢測新方法，從而達到快速、靈敏并且高選擇性的目的，克服現有轉錄因子檢測方法靈敏度低，檢測耗時，成本過高以及步驟繁瑣的缺點。

一種基于DNA-銀納米簇分子信標與核酸外切酶III循環信號放大的轉錄因子檢測方法，其包括如下步驟：

a)將單鏈DNA reporter與其互補單鏈s-reporter在Tris-Ac緩沖液中雜交形成雙鏈探針 dsNF-κB p50 probe；

b)將不同濃度的轉錄因子與dsNF-κB p50 probe孵育，再加入Exo III進行酶切，酶切后加入AgMBs，孵育反應；

c)熒光檢測：測定樣品在561nm激發波長下，620nm處的熒光值。利用測得的I₆₂₀的值，獲得轉錄因子濃度與熒光強度的線性關系。

d)從實際細胞或組織樣品中獲得核蛋白提取物作為待測樣品，根據所得到的線性關系與待測樣品獲得的熒光強度，得到待測樣品中轉錄因子的濃度。

在步驟a)之前，配置Tris-Ac緩沖液，具體配方是10mM Tris-Ac,0.1mM EDTA,100mM NaAc。市售購買本發明所需要的所有DNA寡核苷酸。具體見表1：

表1本發明中使用的DNA序列

步驟a)具體為：用Tris-Ac緩沖液溶解凍干的寡核苷酸，得到100μM的reporter與s-reporter，隨后將二者等體積渦旋，加熱至95℃，維持10min后緩慢降溫至室溫，降溫過程維持至少一小時。