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[發(fā)明專利]一種基于DNA-銀納米簇分子信標與核酸外切酶III循環(huán)信號放大的轉(zhuǎn)錄因子檢測方法有效

專利信息
申請?zhí)枺?/td> 201710062737.X 申請日: 2017-01-25
公開(公告)號: CN106970229B 公開(公告)日: 2018-11-16
發(fā)明(設(shè)計)人: 周學敏;李昺之;徐磊;陳月;朱婉瑩;沈心;洪俊麗 申請(專利權(quán))人: 南京醫(yī)科大學
主分類號: G01N33/68 分類號: G01N33/68
代理公司: 北京思創(chuàng)大成知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司 11614 代理人: 尹慧晶
地址: 210029 江蘇*** 國省代碼: 江蘇;32
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摘要:
搜索關(guān)鍵詞: 一種 基于 dna 納米 分子 信標 核酸外切酶 iii 循環(huán) 信號 放大 轉(zhuǎn)錄 因子 檢測 方法
【說明書】:

發(fā)明公開了一種基于DNA?銀納米簇分子信標與核酸外切酶III循環(huán)信號放大的轉(zhuǎn)錄因子檢測方法,首次將DNA?銀納米簇分子信標這種新型納米材料作為熒光探針應(yīng)用于轉(zhuǎn)錄因子的檢測。并且,基于DNA?銀納米簇分子信標的熒光調(diào)節(jié)是由可以被酶切割的DNA片段這一特征,加入了核酸外切酶III,既參與了信號的轉(zhuǎn)化,又參與了檢測信號的增強。本發(fā)明中轉(zhuǎn)錄因子的檢測方法具有免標記,選擇性高,低成本,靈敏度高的優(yōu)點,能夠?qū)崿F(xiàn)生物樣品中轉(zhuǎn)錄因子的高通量檢測。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于分析檢測技術(shù)領(lǐng)域,具體涉以基于DNA-銀納米簇分子信標與核酸外切酶 III循環(huán)放大的轉(zhuǎn)錄因子檢測方法。

背景技術(shù)

轉(zhuǎn)錄因子(Transcription factors,TFs)是細胞中的一種調(diào)控蛋白,通過與基因中的DNA順式作用元件結(jié)合,來啟動和調(diào)節(jié)基因的轉(zhuǎn)錄過程。研究認為,轉(zhuǎn)錄因子決定了被調(diào)控基因的開啟、關(guān)閉以及表達量,因此在基因表達中起著至關(guān)重要的作用。與此同時,也有大量研究指出,轉(zhuǎn)錄因子的非正常表達與活化,廣泛的存在于人體的病理過程中,這些病理過程包括癌癥的產(chǎn)生于轉(zhuǎn)移、病毒感染、自身免疫疾病等,因此,轉(zhuǎn)錄因子既可以作為一種潛在的診斷標志物,又可以成為臨床治療的靶點。同時轉(zhuǎn)錄因子的表達水平也是基礎(chǔ)生物醫(yī)學研究中的一項重要參數(shù)。

綜上所述,實現(xiàn)免標記,快速、靈敏、高通量檢測轉(zhuǎn)錄因子是現(xiàn)在研究的熱點之一。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的在于提供一種已DNA-銀納米簇分子信標(DNA-Ag nanoclustersmolecular beacons,AgMBs)為熒光探針,并且由核酸外切酶III(Exonuclease III, ExoIII)輔助循環(huán)信號放大的轉(zhuǎn)錄因子檢測新方法,從而達到快速、靈敏并且高選擇性的目的,克服現(xiàn)有轉(zhuǎn)錄因子檢測方法靈敏度低,檢測耗時,成本過高以及步驟繁瑣的缺點。

一種基于DNA-銀納米簇分子信標與核酸外切酶III循環(huán)信號放大的轉(zhuǎn)錄因子檢測方法,其包括如下步驟:

a)將單鏈DNA reporter與其互補單鏈s-reporter在Tris-Ac緩沖液中雜交形成雙鏈探針 dsNF-κB p50 probe;

b)將不同濃度的轉(zhuǎn)錄因子與dsNF-κB p50 probe孵育,再加入Exo III進行酶切,酶切后加入AgMBs,孵育反應(yīng);

c)熒光檢測:測定樣品在561nm激發(fā)波長下,620nm處的熒光值。利用測得的I620的值,獲得轉(zhuǎn)錄因子濃度與熒光強度的線性關(guān)系。

d)從實際細胞或組織樣品中獲得核蛋白提取物作為待測樣品,根據(jù)所得到的線性關(guān)系與待測樣品獲得的熒光強度,得到待測樣品中轉(zhuǎn)錄因子的濃度。

在步驟a)之前,配置Tris-Ac緩沖液,具體配方是10mM Tris-Ac,0.1mM EDTA,100mM NaAc。市售購買本發(fā)明所需要的所有DNA寡核苷酸。具體見表1:

表1本發(fā)明中使用的DNA序列

步驟a)具體為:用Tris-Ac緩沖液溶解凍干的寡核苷酸,得到100μM的reporter與s-reporter,隨后將二者等體積渦旋,加熱至95℃,維持10min后緩慢降溫至室溫,降溫過程維持至少一小時。

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