[發明專利]一種基于DNA-銀納米簇分子信標與核酸外切酶III循環信號放大的轉錄因子檢測方法

有效

• 申請號: 201710062737.X
• 申請日: 2017-01-25
• 公開（公告）號: CN106970229B
• 公開（公告）日: 2018-11-16
• 發明（設計）人: 周學敏;李昺之;徐磊;陳月;朱婉瑩;沈心;洪俊麗
• 申請（專利權）人: 南京醫科大學
• 主分類號: G01N33/68
• 分類號: G01N33/68
• 代理公司: 北京思創大成知識產權代理有限公司 11614
• 代理人: 尹慧晶

1.一種基于DNA-銀納米簇分子信標與核酸外切酶III循環信號放大的轉錄因子檢測方法，其特征在于檢測方法包括如下步驟：

a)將單鏈DNA reporter與其互補單鏈s-reporter在Tris-Ac緩沖液中雜交形成雙鏈探針dsNF-κB p50 probe；在步驟a）之前，配置Tris-Ac緩沖液，具體配方是10mM Tris-Ac,0.1mM EDTA, 100mM NaAc；

b) 10μL，50nM的dsNF-κB probe與體積都是5μL的30nM-2500nM的轉錄因子NF-κB p50的溶液混合，隨后加入3μL，10U/μL的Exo III，在37℃下反應30min；反應緩沖體系：10mMTris–Ac, pH7.5, 100mM KCl,2mM MgCl₂, 0.1mM EDTA, 10%（v/v）glycerol，30min后，向上述反應體系中加入20μL，1μM的AgMBs，37℃下反應2h；

c)測定樣品在561nm激發波長下，620nm處的熒光值，利用測得的I₆₂₀的值，獲得轉錄因子濃度與熒光強度的線性關系；

d）從實際細胞或組織樣品中獲得核蛋白提取物作為待測樣品，根據步驟c)所得到的線性關系與待測樣品獲得的熒光強度，得到待測樣品中轉錄因子的濃度；

其中，

Reporter：GAGGGGACTTTCCCAGCCCCACCCCACCCCACCCTCGTCATCAGATACTTA

s-reporter：ATCTGATGACGAGGGTGGGGTGGGGTGGGGCTGGGAAAGTCCCCTC

制備AgMBs時所用的AgMBs模板的序列為：

CCCTTAATCCCCTCGTCAATGCGATCTGATGACGAGGGTGGGGTGGGGTGGGG。

2.根據權利要求1所述的基于DNA-銀納米簇分子信標與核酸外切酶III循環信號放大的轉錄因子檢測方法，其特征在于：步驟a）具體為：用Tris-Ac緩沖液溶解凍干的寡核苷酸，得到100μM的reporter與s-reporter，隨后將二者等體積渦旋，加熱至95℃，維持10min后緩慢降溫至室溫，降溫過程維持至少一小時。

3.根據權利要求1所述的基于DNA-銀納米簇分子信標與核酸外切酶III循環信號放大的轉錄因子檢測方法，其特征在于，步驟b）所述的AgMBs是通過以下步驟制備得到的：將1OD的AgMBs模板溶解于975μL緩沖液中，加熱至95℃，維持10min后緩慢降溫至37℃，降溫持續時間為1h，隨后加入12μL，10mM新制硝酸銀溶液，渦旋混合后避光4℃反應30min，接著，迅速加入12μL，10mM新制硼氫化鈉溶液，充分振搖混合1min，然后避光4℃反應過夜；其中，所述的緩沖液中為10mM Na₂HPO₄/NaH₂PO₄,100mMCH₃COONa,5 mM Mg(CH₃COO)₂, pH7.5。

4.根據權利要求1所述的基于DNA-銀納米簇分子信標與核酸外切酶III循環信號放大的轉錄因子檢測方法，其特征在于，步驟c）具體為：將樣品低速離心后，裝入石英比色皿進行熒光檢測，檢測條件是激發波長為561 nm，掃描速度為1200 nm min^-1，光電倍增管電壓為700 V，激發狹縫和發射狹縫寬度為5 nm。

5.根據權利要求1所述的基于DNA-銀納米簇分子信標與核酸外切酶III循環信號放大的轉錄因子檢測方法，其特征在于，模型轉錄因子為NF-κB p50。

6.根據權利要求1所述的基于DNA-銀納米簇分子信標與核酸外切酶III循環信號放大的轉錄因子檢測方法，其特征在于，轉錄因子NF-κB p50的濃度范圍是30pM-2.5nM。